趙方方, 劉 洋, 井樂剛, 尹悅佳 , 馮樹丹*, 劉相國*

1.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 哈爾濱 150025; 2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所, 吉林省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長春 130033

由于BT蛋白具有廣譜殺蟲效果，因此能夠代替化學(xué)殺蟲劑在農(nóng)田中廣泛應(yīng)用[1]。但是在BT生物殺蟲劑的使用過程中，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)部分昆蟲對原有的BT蛋白產(chǎn)生了抗性[2]。因此發(fā)現(xiàn)新的抗蟲基因?qū)τ跀U(kuò)大抗蟲譜和增加殺蟲效果具有重要作用。

利用新的抗蟲基因得到的轉(zhuǎn)基因抗蟲作物需要進(jìn)行安全性評價(jià)。根據(jù)《轉(zhuǎn)基因植物安全評價(jià)指南》對于轉(zhuǎn)基因植物新表達(dá)蛋白食用安全性評價(jià)的規(guī)定，若用體外表達(dá)的蛋白質(zhì)作為安全性評價(jià)的實(shí)驗(yàn)材料，需提供體外表達(dá)蛋白質(zhì)與植物中新表達(dá)蛋白質(zhì)等同性分析的資料[3]。在安全評價(jià)過程中，需要提供大量外源蛋白，而轉(zhuǎn)基因作物本身產(chǎn)生的外源蛋白一般含量很低，而且難以富集和純化，無法滿足實(shí)驗(yàn)需要[4]，經(jīng)常需要通過原核生物或真核生物等體外表達(dá)系統(tǒng)來誘導(dǎo)表達(dá)外源基因所編碼的蛋白。本實(shí)驗(yàn)所用的基因cryNGC是吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所開發(fā)的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗蟲基因(專利號：CN104725516 A)[5]。本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了CryNGc抗蟲蛋白，并且利用His標(biāo)簽純化了該蛋白；通過SDS-PAGE、Western Blot、質(zhì)譜分析對抗蟲蛋白CryNGc與理論表達(dá)蛋白進(jìn)行了等同性分析。CryNGc蛋白的等同性研究可以為今后該轉(zhuǎn)基因作物的環(huán)境釋放提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1植物材料 轉(zhuǎn)cryNGc基因抗蟲玉米種子由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所提供。

1.1.2菌株與質(zhì)粒 原核表達(dá)載體pCzn1、表達(dá)菌株Arctic-Express和大腸桿菌感受態(tài)TOP10菌株購自南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司。

1.1.3主要試劑與耗材 聚丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺(TEMED)購自上海生工生物工程有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 購自 Sigma 公司，Proteinlso Ni-NTA Resin Kit、瓊脂糖、Blue Plus Ⅱ Protein Marker、2×EasyTaqSuperMix、Easysee Western Blot Kit、兔源二抗購自北京全式金生物公司； Cry1Ab一抗購自Abcam 生物公司；配制培養(yǎng)基所用的胰蛋白胨、酵母提取物購自 Oxoid 生物公司； 限制性內(nèi)切酶購自 Thermo Fisher 科技公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。0.45 μm無菌濾器和PVDF印跡膜購自Millipore 生物公司；其他耗材購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1原核表達(dá)載體的構(gòu)建 采用基于 PAS(PCR-based accurate synthesis)的方法合成全長為 1 833bp 的基因cryNGc。依據(jù)目的基因和載體 pCzn1 的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)一對引物cryNGc-F：5’-CCATATGGGTTGCCCATTGTCCCATA-3’；cryNGc-R：5’-CTCTAGAGCCGAACATAAACGAGTGC-3’，上游引物和下游引物分別引入酶切位點(diǎn)NdeⅠ和XbaⅠ(下劃線所示)，經(jīng) PCR 擴(kuò)增、膠回收后，將回收的基因與載體 pCzn1 連接(圖1)，獲得重組質(zhì)粒pCzn1-cryNGc；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 TOP10 菌株中然后涂布于含有氨芐青霉素(Amp)的 LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃ 過夜培養(yǎng)；挑取單克隆后，以所選單克隆為模板進(jìn)行 PCR 檢測獲得陽性克?。粚⑵鋽U(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定無誤后送生物公司測序。

圖1 原核表達(dá)載體pCzn1-cryNGc的構(gòu)建Fig.1 Construction of expression vector pCzn1-cryNGc注：cspA：大腸桿菌冷休克基因啟動子；TEE：煙草蝕紋病毒增強(qiáng)子；cryNGc：抗蟲目的基因；Amp：氨芐青霉素抗性基因；LacⅠ：大腸桿菌乳糖操縱子調(diào)節(jié)基因

1.2.2重組質(zhì)粒 pCzn1-cryNGc的表達(dá) 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化參考陳洪棟等[6]的方法；蛋白表達(dá)參考林亨咪[7]的方法，然后將每步的樣品進(jìn)行 SDS-PAGE 分析。

1.2.3包涵體蛋白的變復(fù)性 包涵體的變性以及復(fù)性相關(guān)實(shí)驗(yàn)步驟參考付明娟等[8]的方法。

1.2.4表達(dá)后重組蛋白的純化 用 Ni-NTA Agroase 進(jìn)行重組蛋白的純化，以 5～10 倍體積的平衡緩沖液平衡柱子，待液體流盡之后，加入上述溶解之后的包涵體溶液，以 5～10 倍體積的含有 20 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫雜蛋白2次，液體流盡后，以含有 250 mmol/L 咪唑的洗脫液洗脫目的蛋白。

1.2.5轉(zhuǎn)基因玉米葉片蛋白的提取 溫室種植轉(zhuǎn)cryNGc基因植株，長至 5～6 葉期時(shí)采集葉片進(jìn)行 PCR 檢測，在已檢測的植株中，選取轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株各3株作為蛋白提取材料備用。轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株每株各取 1 g，液氮研磨之后裝入 15 mL 離心管中，每管中加入 6 mL 蛋白提取緩沖液(每 10 mL PBS加 1 片蛋白酶抑制劑)，渦旋振蕩混勻后，4℃ 12 000 g 離心 10 min，取上清即為植物總蛋白，-20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6Western Blot 分析 取預(yù)染Marker、純化后的 CryNGc 蛋白、誘導(dǎo)后的菌體蛋白、超聲波破碎后的菌體蛋白、轉(zhuǎn)基因玉米蛋白、空載體(pCzn1)進(jìn)行 SDS-PAGE(5%濃縮膠和12%分離膠)，80V 電壓下跑出濃縮膠后，再將電壓調(diào)至 120 V，待溴酚藍(lán)跑出膠外停止電泳；然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(半干轉(zhuǎn)，10 V 轉(zhuǎn)膜，觀察預(yù)染 Marker 完全轉(zhuǎn)印到膜上之后停止轉(zhuǎn)膜，大約40 min)，將轉(zhuǎn)好的膜放入封閉液(5%的脫脂奶粉)25℃ 封閉 1.5 h 之后，進(jìn)行一抗(1∶1 000)、二抗(1∶5 000)孵育，洗膜之后在暗室進(jìn)行發(fā)光、壓片、顯影，最后對膠片進(jìn)行掃描，得到結(jié)果。

1.2.7LC-MS-MS(液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜)分析

從考馬斯亮藍(lán)染色的膠上切下直徑 0.3 mm 的目標(biāo)蛋白膠條，以膠內(nèi)消化脫色液(50%乙腈，25 mmol/L碳酸氫銨)對膠粒消化脫色2次，待膠粒脫水至完全變白時(shí)真空抽干乙腈；加入 10 mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)，56℃ 水浴鍋內(nèi)孵育 1 h，孵育完畢后移除多余的 DTT；加入 55 mmol/L 的碘代乙酰胺(IAM)，暗室孵育 45 min，孵育完畢后移除多余的 IAM，加入 25 mmol/L 的碳酸氫銨清洗2次，每次10 min；移除碳酸氫銨，以脫色液清洗 2 次，每次 10 min，真空抽干乙腈；將1 μg/μL的胰蛋白酶用 25 mmol/L 的碳酸氫銨稀釋 15 倍后加入到膠粒中，37℃ 水浴過夜消化；取 10 μL 樣品上機(jī)用質(zhì)譜儀檢測，結(jié)果進(jìn)行 Mascot 檢索(http://www.matrixscience.com)比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與驗(yàn)證

將陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果表明(圖2)，已成功從原核表達(dá)載體上切得1 833 bp的目的基因，未酶切的質(zhì)粒有3條帶是因?yàn)橘|(zhì)粒本身有著不同的形態(tài)所導(dǎo)致。將質(zhì)粒送公司測序，結(jié)果表明原核表達(dá)載體 pCzn1-cryNG構(gòu)建成功。

圖2 表達(dá)載體 pCzn1-CryNGc的酶切驗(yàn)證結(jié)果Fig.2 Restriction enzyme digestion of expression vector pCzn1-CryNGc.注：M：DL 15 000 Marker；1：酶切前的質(zhì)粒；2：酶切后的質(zhì)粒

2.2 重組蛋白的表達(dá)和純化

蛋白表達(dá)結(jié)果如圖3A所示，CryNGc 重組蛋白以包涵體形式在沉淀中表達(dá)，上清中未見蛋白表達(dá)。箭頭所示為目的蛋白條帶，大小約為 65 kDa，根據(jù)理論推測蛋白大小為 60～67 kDa，實(shí)際大小在預(yù)測范圍之間，在電泳過程中，電泳液的酸堿性以及電壓的穩(wěn)定性都會影響電泳結(jié)果，因此會存在誤差，所以實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可信的。本實(shí)驗(yàn)采用的啟動子為大腸桿菌冷休克啟動子，因此在圖3A泳道2所示37℃時(shí)蛋白表達(dá)量小于泳道4的13℃。蛋白純化結(jié)果如圖3B所示，未純化的包涵體蛋白和 20 mmol/L的咪唑洗滌后的蛋白都有拖尾，而以250 mmol/L咪唑洗脫之后的蛋白如箭頭所示無拖尾現(xiàn)象，表明得到了純化后的蛋白。

2.3 轉(zhuǎn)cryNGc基因玉米總蛋白的提取和檢測

轉(zhuǎn)基因玉米蛋白檢測結(jié)果如圖4所示，和野生型玉米相比，轉(zhuǎn)基因玉米有如箭頭所示的目的蛋白條帶，證明 CryNGc 蛋白在轉(zhuǎn)基因玉米中能成功表達(dá)。

圖3 CryNGc 重組蛋白的表達(dá)及純化Fig.3 Expression and purification of recombinant CryNGc protein.注：A. CryNGc重組蛋白的表達(dá)：M: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn); 1:未誘導(dǎo)的重組蛋白; 2:誘導(dǎo)后的重組蛋白; 3: 0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的上清; 4: 0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的沉淀。B. CryNGc重組蛋白的純化：M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn); 1:未純化的包涵體溶液; 2:20 mmol/L咪唑洗滌流出液; 3: 250 mmol/L咪唑洗脫純蛋白。

圖4 轉(zhuǎn)基因玉米CryNGc蛋白的 SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of protein CryNGc in transgentic maize.注：M: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn); 1：野生型玉米; 2：轉(zhuǎn)基因玉米

2.4 Western Blot分析

Western Blot 結(jié)果如圖5，陽性對照、誘導(dǎo)后的蛋白、破碎后的包涵體蛋白、轉(zhuǎn)基因玉米蛋白都得到如圖條帶，空載體和轉(zhuǎn)基因陰性植株無條帶，cryNGc基因在大腸桿菌和轉(zhuǎn)基因玉米中都能進(jìn)行表達(dá)且大小一致，與陽性對照相比，泳道2條帶較粗，原因是CryNGc蛋白以包涵體形式表達(dá)，在未經(jīng)超聲波破碎的條件下目的蛋白處于折疊狀態(tài)，純度不高，所以雜交結(jié)果不如純化后的蛋白。可以看出蛋白的純度高低對于Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要。

圖5 CryNGc 原核蛋白和轉(zhuǎn)基因玉米蛋白的 Western Blot 結(jié)果Fig.5 The Western Blot results of CryNGc protein in E. coli and transgenic maize.注：1：陽性對照(CryNGc純蛋白)；2：誘導(dǎo)后的蛋白沉淀；3：超聲波破碎后的蛋白沉淀；4：轉(zhuǎn)基因玉米；5：空載體；6：非轉(zhuǎn)基因玉米

2.5 pCzn1-cryNGc原核蛋白和轉(zhuǎn)基因玉米蛋白的質(zhì)譜分析

以 CryNGc 重組蛋白和轉(zhuǎn)基因玉米蛋白做質(zhì)譜分析，然后將質(zhì)譜結(jié)果用 Mascot 檢索比對，因?yàn)閏ryNGc基因是從cry1Ab基因改造而來，因此以 CryNGc 重組蛋白和轉(zhuǎn)基因玉米蛋白和 Cry1Ab 蛋白比對，結(jié)果如圖6所示，劃線部分為兩種蛋白和 Cry1Ab 蛋白的成功匹配部分并且氨基酸序列相同。因?yàn)樵跀?shù)據(jù)庫中Cry1Ab蛋白是已知的，以它為橋梁將原核表達(dá)蛋白和轉(zhuǎn)基因玉米蛋白聯(lián)系起來進(jìn)行對比，結(jié)果證明兩種蛋白在氨基酸序列上存在等同性。

3 討論

利用原核表達(dá)的外源蛋白代替植物蛋白進(jìn)行等同性實(shí)驗(yàn)和其他一系列驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)對于提高實(shí)驗(yàn)效率有著重要的作用。但是以微生物表達(dá)的蛋白代替轉(zhuǎn)基因植物中目的蛋白, 需要符合以下等同性驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)：①兩者在二維凝膠電泳中表現(xiàn)一致；②具有相同的結(jié)合單克隆、多克隆抗體的免疫反應(yīng)性；③具有相同的翻譯后修飾(如糖基化)；④具有相似的氨基酸序列( N 末端 10～15 個(gè)氨基酸序列至少 3 個(gè)短的內(nèi)部蛋白序列)[9]。本實(shí)驗(yàn)選取了免疫活性和相似的氨基酸序列兩項(xiàng)指標(biāo)。大腸桿菌表達(dá)的蛋白和植物蛋白在 SDS-PAGE 凝膠上大致位置相同，分子量相近；在 Western Blot 分析中，兩種蛋白條帶和陽性對照基本處于同一位置，證明兩種蛋白具有相同免疫反應(yīng)，這和徐海濱等[10]在研究cry1Ie基因時(shí)所得的 Western Blot結(jié)果相同，也符合cry系列抗蟲基因在免疫活性的一致性；參考李敏[11]對兩種蛋白做的質(zhì)譜檢測，結(jié)果利用 Mascot 檢索比對，原核表達(dá)蛋白、植物蛋白和抗蟲蛋白 Cry1Ab 的氨基酸匹配區(qū)段相同，證明兩種蛋白的氨基酸組成基本一致。就目的蛋白的關(guān)鍵特性——氨基酸序列和免疫活性而言，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的目的蛋白與轉(zhuǎn)基因植物目的蛋白基本是等同的，可以在后續(xù)的安全評價(jià)實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮作用。盡管利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白得到的蛋白量比較少，但是也為等同性的驗(yàn)證提供了可行的方法，如果利用發(fā)酵工藝在工業(yè)水平上表達(dá)和純化蛋白，將會解決實(shí)驗(yàn)室所得蛋白量少的問題，為后續(xù)在環(huán)境安全評價(jià)中的蛋白等同性實(shí)驗(yàn)提供了可行的方法。

圖6 Mascot 比對結(jié)果Fig.6 Mascot comparison results.A.原核表達(dá)蛋白和Cry1Ab蛋白氨基酸序列比對；B.轉(zhuǎn)基因玉米蛋白和Cry1Ab蛋白氨基酸序列對

[1] Schnepf E, Crickmore N, Van R J,etal..Bacillusthuringiensisand its pesticidal crystal proteins[J]. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 1998, 62(3): 775-806.

[2] 魏秋學(xué). 棉鈴蟲對轉(zhuǎn)Bt基因棉抗性的分子檢測方法研究[D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),碩士學(xué)位論文，2008.

[3] 甄二東. 利用體外培養(yǎng)細(xì)胞系評價(jià)外源蛋白安全性的研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 碩士學(xué)位論文，2016.

[4] 李飛武, 劉 信, 張 明,等. 國外轉(zhuǎn)基因生物安全檢測機(jī)構(gòu)發(fā)展現(xiàn)狀及趨勢[J]. 農(nóng)業(yè)科技管理, 2009, 28(3):33-36.

[5] 閆瑋玉. 轉(zhuǎn)cryNGc基因水稻的抗蟲性研究[D]. 長春：東北師范大學(xué),碩士學(xué)位論文，2016.

[6] 陳洪棟, 董文博, 李紅民. 一種用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的實(shí)用操作技巧[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2009(s1):297-299.

[7] 林亨咪. 玉米抗蟲蛋白基因原核表達(dá)載體構(gòu)建及活性研究[D]. 哈爾濱：黑龍江大學(xué), 碩士學(xué)位論文，2013.

[8] 付明娟, 林接玉, 謝捷明. 包涵體蛋白復(fù)性的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述, 2015(20):3657-3659.

[9] 崔浩然, 郎志宏, 朱 莉,等. 微生物蛋白與轉(zhuǎn)基因作物蛋白等同性比較[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2013(9):13-17.

[10] 徐海濱, 張曉霞, 李 芳,等.Cry1Ie基因在大腸桿菌中的表達(dá)及等同性鑒定[J]. 衛(wèi)生研究, 2007, 36(1):45-48.

[11] 李 敏. 重組抗除草劑蛋白aroA-CC-M與轉(zhuǎn)Cry1Ac-M基因抗蟲玉米Bt-799的食用安全性評價(jià)[D]. 北京：中國疾病預(yù)防控制中心, 碩士學(xué)位論文，2012.