任向峰， 姚 婷， 張 萌， 張 燕， 王友升

(北京工商大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心， 北京 100048)

*王友升，男，教授，博士，主要從事果蔬綠色保鮮及其高值化方面的研究，通信作者。

鏈格孢屬(AlternariaNees) 真菌作為果實(shí)采后常見的潛伏侵染病原菌，是半知菌暗色絲孢菌中重要的一類[1]，目前，全世界已經(jīng)報(bào)道的鏈格孢屬真菌約500種且仍不斷發(fā)現(xiàn)新種[2-3]，僅在果蔬常見的就有互隔交鏈孢(A.alternata)[4]、細(xì)極鏈格孢菌(A.tenuissima)[5]、胡蘿卜鏈格孢(A.dauci)[6]和蔥鏈格孢(A.porri)[7]等，但對于屬內(nèi)種間的親緣關(guān)系尤其碳源代謝指紋圖譜的差異性，需要進(jìn)一步理清。

利用不同物種間核糖體DNA的ITS區(qū)可能存在的堿基差異性，通過PCR擴(kuò)增ITS區(qū)并進(jìn)行同源性分析，可以對真菌進(jìn)行鑒定[8-9]。Biolog 微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)可通過檢測特定菌株對95種碳源的利用情況，獲得該菌種的碳源代謝指紋圖譜[10-12]。拮抗酵母菌的ITS區(qū)序列與碳源代謝指紋圖譜可有效獲取其生防能力的差異性基礎(chǔ)[13]。將ITS區(qū)序列與碳源代謝指紋圖譜表型特征相結(jié)合，對桃、李果實(shí)采后褐腐病菌的親緣關(guān)系進(jìn)行區(qū)分，且兩種方法具有可比性[14]。前期的研究也表明，通過李果實(shí)采后病原菌串珠狀赤霉(Gibberellamoniliformis)、鏈格孢菌(Alternariaalternata)、 草酸青霉(Penicilliumoxalicum)和塔賓曲霉(Aspergillustubingensis)之間的ITS區(qū)序列與碳源代謝指紋圖譜表型差異可推測出病原菌寄主特異性的物質(zhì)基礎(chǔ)[15]。

本研究分別從采后貯藏期發(fā)病的冬棗、櫻桃、杏和藍(lán)莓果實(shí)中分離得到4株病原真菌，通過形態(tài)學(xué)特征和rDNA ITS區(qū)序列分析進(jìn)行鑒定，并對分子系統(tǒng)進(jìn)化樹和碳源指紋聚類分析結(jié)果進(jìn)行比較，以期為不同果實(shí)采后病原菌的營養(yǎng)生理研究、病害防治及真菌種間關(guān)系研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1菌株

絲狀病原真菌231#、320#、322#和333#分別從采后貯藏過程中自然發(fā)病的冬棗、櫻桃、杏及藍(lán)莓果實(shí)分離得到。

1.1.2培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)和麥芽浸粉培養(yǎng)基(malt extract agar，ME)按照參考文獻(xiàn)[16]制備。

1.1.3試劑

DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)2×Taq PCR Master Mix，天根生化試劑公司；通用引物ITS-4和ITS-5，Invitrogen公司合成。三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸鈉(EDTA)、十二烷基磺酸鈉(SDS) ，Amersco公司，乙醇、鹽酸均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Imager 2200型凝膠成像系統(tǒng)，美國Alpha公司；MJX-250Ⅱ型霉菌培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠；Axio Image A1型顯微鏡，德國Zeiss公司；PCR儀，美國Bio-RAD公司；生物安全柜，美國Thermo公司；微生物鑒定系統(tǒng)，美國BIOLOG公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1菌種的分離、純化與回接

分離：取發(fā)病冬棗、櫻桃、杏和藍(lán)莓果實(shí)的病、健交界處組織于PDA上，25 ℃培養(yǎng)3 d。

純化：從分離菌菌落的外沿取菌塊，分別三點(diǎn)轉(zhuǎn)接到PDA和ME上，25 ℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)特征。

回接：挑選健康無損傷的冬棗、櫻桃、杏和藍(lán)莓果實(shí)，75%乙醇表面消毒，用無菌接種針刺孔，取純化后的菌塊接種至傷口處，觀察果實(shí)接種處的病癥。

1.3.2形態(tài)學(xué)觀察

取純化在PDA平板上的菌落外緣，分別采用三點(diǎn)接種法轉(zhuǎn)接到PDA和ME平板上，25 ℃培養(yǎng)7 d和14 d后觀察菌落形態(tài)。在潔凈載玻片上，滴一滴乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液，將插片培養(yǎng)的蓋玻片置染色液中，蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察分生孢子及分生孢子梗的形狀、色澤和分生孢子隔膜等性狀。

1.3.3基因組DNA的提取及ITS區(qū)PCR擴(kuò)增與序列測定

采用改良后SDS-氯化芐法[9]提取DNA。ITS-F(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS-R(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)為引物，PCR擴(kuò)增ITS區(qū)，PCR產(chǎn)物由北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行脫鹽、純化和雙向測序，CExpress軟件拼接，拼接序列在網(wǎng)站https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上進(jìn)行核酸比對，在GeneBank數(shù)據(jù)庫中找目的菌株同源序列，通過MEGA6軟件進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.3.4碳源代謝指紋圖譜分析

待測菌株在PDA培養(yǎng)基平板上26 ℃培養(yǎng)120 h后，用FF-IF濁度標(biāo)準(zhǔn)液制備T=(75±2)%的菌懸液，T為透光率。在FF微孔板中每孔加100 μL菌懸液，26 ℃培養(yǎng)7 d后，用Biolog微生物鑒定系統(tǒng)讀取FF培養(yǎng)結(jié)果，獲得病原菌的代謝指紋圖譜[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與回接

分別從自然發(fā)病的冬棗、“紅燈”甜櫻桃、黃杏和“藍(lán)豐”藍(lán)莓果實(shí)發(fā)病部位分離到絲狀病原真菌231#、320#、322#和333#，見圖1。其中，將分離得到菌株純化后回接到冬棗(圖1a)、“紅燈”甜櫻桃(圖1b)、黃杏(圖1c)、和“藍(lán)豐”藍(lán)莓(圖1d)果實(shí)后，在接種部位均出現(xiàn)相同病癥(圖1e～h)，并能從該病害部位再次分離得到相應(yīng)病原菌(結(jié)果未列出)，因此，可確定它們均為相應(yīng)果實(shí)的病原菌。

2.2 病原菌的形態(tài)觀察

2.2.1菌落形態(tài)

圖1 4株病原真菌在不同果實(shí)上分離與回接時(shí)的病癥Fig.1 Symptoms of isolated fruits and reinoculated fruits of four fungal pathogens

圖2 4株病原菌在PDA和ME 25 ℃培養(yǎng)7 d的菌落特征Fig.2 Colony growth of four isolated strains cultured on ME and PDA plates for 7 d at 25 ℃

4株病原菌在PDA和ME培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d后均生長旺盛，見圖2，菌落邊緣清晰、質(zhì)地緊密、外觀干燥而不透明。相比而言，菌株231#在PDA上菌落已長滿平板呈灰褐色、輪紋不明顯，而ME平板上菌絲灰白色、有輪紋(圖2a,e)。菌株320#菌落整體呈灰綠色，PDA平板中央顏色較深(圖2b,f)。菌株322#在PDA上菌絲白色中央呈褐色，而ME上菌落呈均勻白色(圖2c,g)。菌株333#整體呈灰綠色，中央顏色較深，在ME上生長迅速，幾乎長滿平板(圖2d,h)。

2.2.2顯微形態(tài)

4株病原菌的個(gè)體形態(tài)基本一致，見圖3，分生孢子呈倒棒狀，頂端延長成喙?fàn)?，淡褐色，有壁磚狀分隔，暗褐色，成鏈生長，孢子的形態(tài)及大小基本一致(圖3a～d)。菌絲著色較淺，分枝多且內(nèi)部隔膜觀察較為明顯(圖3e～h)。

將上述4株絲狀真菌的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)的結(jié)果與《真菌鑒定手冊》[17]對絲狀真菌菌落、菌絲和孢子的描述進(jìn)行比較，確定菌株231#、320#、322#和333#均為鏈格孢屬真菌。

2.3 基因組DNA PCR擴(kuò)增

以ITS-F和ITS-R為引物，4株病原菌基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外檢測的結(jié)果見圖4，可以看出，DNA片段大小約600 bp，片段長度存在一定的差異，可能由于rDNA ITS區(qū)存在長度和序列多態(tài)性[18]。

2.4 構(gòu)建ITS區(qū)rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹

將4株病原真菌的rDNA ITS區(qū)序列在NCBI網(wǎng)站上比對，并且在GeneBank數(shù)據(jù)庫中搜索同源序列，利用MEGA6軟件構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖5?？梢钥闯觯?株病原真菌中，菌株320#和322#在進(jìn)化樹中與A.alternata(AY625056.1)在同一分枝，置信度支持率達(dá)100%；而菌株231#與333#和A.tenuissima(KP324980.1)的親緣性較近，置信度支持率為100%。

2.5 碳源代謝指紋圖譜分析結(jié)果

4株鏈格孢菌的碳源代謝指紋圖譜見表1。4株病原菌對95種碳源的代謝指紋圖譜類似，它們共同的碳源代謝指紋圖譜有86種，包括吐溫80、N-乙酰-D-葡萄糖胺、核糖醇和苦杏仁苷等78種最適碳源，以及N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰基-β-D-甘露糖胺、L-海藻糖、葡萄糖醛酰胺、景天庚醛聚糖、N-乙酰-L-谷氨酸、L-焦谷氨酸、2-氨基乙醇8種不可利用碳源，而對β-環(huán)式糊精、D-葡萄糖胺、肝糖、D-塔格糖、D-木糖、γ-羥丁酸、D-乳酸甲酯、腐胺、鳥苷則因株菌不同而存在顯著差異。此外，菌株231#、320#、322#和333#與BIOLOG數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)菌株A.alternata(Fr.) Keissl代謝能力相同的碳源均達(dá)到70種以上，其中231#與A.alternata(Fr.) Keissl的代謝指紋圖譜最近，71種代謝相同的碳源包括核糖醇、苦杏仁苷和D-阿拉伯糖等65種最適碳源，以及N-乙酰-β-D-甘露糖胺、L-海藻糖和葡糖醛酰胺等6種不可利用碳源。

圖3 4株病原菌的顯微形態(tài)觀察Fig.3 Morphological characteristics of four fungal pathogens

圖4 4株病原真菌的ITS 區(qū)rDNA電泳檢測圖譜Fig.4 Agarose gel electrophoresis results of ITS rDNA sequence of four strains

圖5 4株以ITSr DNA基因序列為分子標(biāo)記的鏈格孢菌菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Position of four fungi strains based on ITS rDNA sequence in phylogenetic tree

以4株病原真菌(AlternariaNees)對95種碳源的利用作為聚類變量，采用比對法在MEGA6中構(gòu)建碳源利用的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖6?？梢钥闯?，通過系統(tǒng)聚類分析可以清楚區(qū)分出4株病原真菌的碳源代謝特征，表明不同菌株之間在碳源代謝利用上的差異性，其中231#與A.alternaria(Fr.) Keissl的代謝指紋圖譜最接近，而320#的代謝指紋圖譜與A.alternaria(Fr.) Keissl的差異較大。

3 討 論

本研究的結(jié)果表明，引起櫻桃320#和杏322#黑腐病的病原菌為A.alternata，這與張娜等[19]、韓盛等[20]報(bào)道的相一致，該病原菌還可以引起蘋果、臺(tái)灣青棗、核桃黑斑病[21-23]。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)棗231#為A.tenuissima，這與李靜琴等[24]報(bào)道相一致，但目前對藍(lán)莓黑腐病的鏈格孢菌只確定到屬，而本研究將藍(lán)莓333#確定為A.tenuissima。

表1 4株鏈格孢菌的碳源代謝指紋圖譜

1)a表示最適碳源，b表示可利用碳源，c表示不可利用碳源；2)參考菌株為Alternariaalternata(Fr.) Keissl，其碳源代謝能力數(shù)值是指具有該代謝特征的菌株頻率；3)待測菌株的碳源利用值是指該碳源所在孔與A1孔在750 nm處吸光度差值的1 600倍。

圖6 4株鏈格孢屬真菌碳源代謝指紋圖譜的聚類分析Fig.6 Clustering drawing of four fungal pathogens by gresemblance of metabolic fingerprinting

不同桃、李果實(shí)采后褐腐病菌的rDNA ITS區(qū)序列親緣性關(guān)系分析和碳源代謝指紋圖譜分析結(jié)果表明，兩種方法對5株桃、李果實(shí)采后褐腐病菌的分類結(jié)果一致，可以反映褐腐病菌種內(nèi)親緣關(guān)系，且兩種方法具有可比性[14]。但本研究對4株鏈格孢菌ITS區(qū)序列的變異性分析發(fā)現(xiàn)，320#和322#與A.alternata(AY625056.1) 在同一分枝；棗231#與藍(lán)莓333#和A.tenuissima(KP324980.1)的親緣關(guān)系較近。然而，碳源代謝指紋圖譜的結(jié)果表明，320#和333#在同一分枝上，與Biolog系統(tǒng)中的模式菌株A.alternata(Fr.) Keissl差異最大，231#與A.alternata(Fr.) Keissl對碳源的利用情況最相似，表明4株鏈格孢菌的ITS區(qū)序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分類與碳源代謝聚類分析結(jié)果存在一定差異，即它們在ITS區(qū)堿基序列上的差異性與對95種碳源的利用差異性并不完全一致。這可能由于4株鏈格孢菌的碳源代謝除受自身遺傳限制外，還受菌體自身生長狀況等環(huán)境條件影響。

侵染性病害的發(fā)病過程常受到寄主自身營養(yǎng)條件的限制。本研究的碳源代謝圖譜表明，4株菌可以利用的碳源都在88種以上，暗示鏈格孢菌對不同碳源的適應(yīng)性較強(qiáng)，這可能是該屬病原菌侵染范圍廣、難以進(jìn)行有效生物防治的原因。因此，利用通過營養(yǎng)與空間競爭發(fā)揮生防效果的拮抗酵母菌來防治鏈格孢菌導(dǎo)致的病害，需進(jìn)一步深入挖掘碳源代謝指紋圖譜的特異性。

4 結(jié) 論

本研究分離到的4株病原真菌，確定均為鏈格孢屬真菌(AlternariaNees)。碳源代謝指紋圖譜分析表明，分離到的4株鏈格孢菌可利用碳源均達(dá)88種以上，對宿主碳源營養(yǎng)成分適應(yīng)性很強(qiáng)，這應(yīng)該是鏈格孢屬真菌侵染范圍廣的原因。4株鏈格孢屬真菌的ITS區(qū)序列分子鑒定分類與碳源代謝聚類結(jié)果存在一定差異。

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