郭亞飛 王君雅 郭飛 倪德江

（華中農(nóng)業(yè)大學園藝林學學院 園藝植物生物學教育部重點實驗室，武漢 430070）

茶樹（Camellia sinensis（L.）O. Kuntze）是葉用多年生木本植物。香氣成分是決定茶葉品質(zhì)的重要物質(zhì)。萜類化合物是茶葉香氣的重要成分之一，約占春季茶葉香氣揮發(fā)物總量的 52.2%［1］。萜類化合物以異戊二烯為基本單位聚合而成，根據(jù)所含異戊二烯單位數(shù)目可分為單萜、倍半萜、雙萜、四萜及多萜等。其中芳樟醇、香葉醇、橙花醇等單萜類化合物賦予茶葉怡人的花果香，四萜類化合物類胡蘿卜素降解生成的紫羅酮類化合物及其衍生物也是茶葉香氣的重要組分［2］。萜類化合物的合成受到多種關(guān)鍵酶的調(diào)控，其合成途徑根據(jù)是否含有甲羥戊酸中間產(chǎn)物而分為甲羥戊酸（Mevalonate pathway，MVA）途徑和2-甲基-4-磷酸赤蘚糖（Methylerythritol 4-phosphate pathway，MEP）途徑，這兩個途徑同時存在于真核生物體內(nèi)，分別定位于細胞質(zhì)基質(zhì)和質(zhì)體［3］。

1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase，DXS）是MEP途徑的第一個酶也是該途徑的關(guān)鍵調(diào)控酶，對單萜和雙萜類香氣化合物以及類胡蘿卜素、葉綠素等重要物質(zhì)的合成具有關(guān)鍵調(diào)控作用［4］，DXS將MEP途徑的初始底物丙酮酸和 3-磷酸甘油醛轉(zhuǎn)化成 1-脫氧-D-木 酮 糖 -5-磷 酸（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate，DXP），DXP 再經(jīng)由后續(xù)的反應生成所有萜類化合物的合成前體異戊烯基焦磷酸（Isopentenylallyl diphosphate，IPP）和二甲烯丙基焦磷酸（Dimethylallyl diphosphate，DMAPP）［5］。以往茶葉的萜類研究多集中在香氣物質(zhì)的理化分析和鑒定以及栽培、加工技術(shù)對香氣成分的影響方面［6-7］，而有關(guān)萜類化合物代謝途徑分子生物學方面的研究開展較少。本研究在課題組前期轉(zhuǎn)錄組測序的基礎上，從福鼎大白茶中成功克隆茶樹CsDXS1基因的完整開放閱讀框（ORF），對該基因的生物信息學特征進行了全面的分析，并進一步對其在茶樹不同組織中和激素水平處理下的表達水平進行了檢測，以期為下一步深入研究CsDXS1的生物學功能提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為 5 年生國家茶樹品種福鼎大白茶無性系，種植于湖北省武漢市華中農(nóng)業(yè)大學種質(zhì)資源圃。選取福鼎大白茶的一芽一葉，作為后續(xù)基因克隆的材料。

激素處理：分別以乙烯利（1 mmol/L ETH）、脫落酸（0.1 mmol/L ABA）、生長素（1 mmol/L IAA）、赤霉素（1 mmol/L GA3）、水楊酸（1 mmol/L SA）和茉莉酸甲酯（1 mmol/L MeJA）激素處理處理長勢一致、生長健康、正常、無病蟲侵害的植株，分別在處理后 0 h（作為對照）、2、4、8和 24 h 采樣，液氮速凍于-80℃儲藏備用。

基因組織表達特異性：分別取多株茶樹的第一葉混樣、第二葉混樣、第三葉混樣、第四葉混樣、老葉混樣、嫩莖混樣和老莖混樣，取樣后迅速置液氮中冷凍后，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA合成 使用 EASYspin Plus Plant RNA kit 試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取茶樹一芽一葉的總 RNA，提取的總RNA 樣品濃度和質(zhì)量用微量分光光度計和1% 凝膠電泳進行檢測。以質(zhì)量符合要求的 RNA 樣品為模板，參照 TRUEscript RT MasterMix 說明書（北京艾德萊生物科技有限公司）進行反轉(zhuǎn)錄反應，合成的cDNA第一鏈，作為后續(xù)PCR擴增的模板。

1.2.2 茶樹DXS基因克隆 根據(jù)課題組茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中CsDXS1基因的轉(zhuǎn)錄本序列，設計特異性引物（表 1），以上述合成的福鼎大白茶一芽一葉cDNA 為模板進行 PCR 擴增。擴增體系：模板1 μL、2×Ultra-Pfu Master Mix 12.5 μL、ddH2O 9.9 μL、正反引物各0.8 μL。擴增程序：94℃預變性3 min；94℃變性 20 s，61℃退火 20 s，72℃延伸 2 min，共38個循環(huán)；72℃補充延伸7 min 后終止反應。用1%凝膠電泳進行目的擴增產(chǎn)物的分離和回收純化。將回收產(chǎn)物與載體 pTOPO-Blunt Simple（北京艾德萊生物科技有限公司）相連并成功轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，篩選陽性克隆并送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.2.3 生物信息學分析 利用 DNAMAN 軟件分析預測其編碼的蛋白；利用 NCBI 中的 BlastP 在線工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行蛋白序列的同源比對；利用 MEGA 7.0 軟件的 NJ 法對茶樹CsDXS1蛋白序列進行聚類分析；運用序列處理在線工具包 ExPASy-Protparam（http://web.expasy.org/protparam/）分析茶樹CsDXS1蛋白的氨基酸組成及其理化性質(zhì)；運用在線工具 NetPhos3.1 server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析和預測磷酸化修飾位點；運用 ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/）分析和預測茶樹CsDXS1蛋白的親水性/疏水性；運用在線工具 TMHMM server 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進行跨膜結(jié)構(gòu)域的分析和預測；運用 NCBI 上的 CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）和ExPASy-Prosite（http://prosite.expasy.org/）分析蛋白質(zhì)的保守域和功能位點。

表 1 引物序列

1.2.4 茶樹CsDXS1基因的表達特性分析 實時熒光定量 PCR（Quantitative real time RT-PCR）實驗按照TRUEscript RT MasterMix（北京艾德萊生物科技有限公司）試劑盒的操作說明進行。ABI StepOne Plus real-time PCR system 作為熒光定量PCR平臺。根據(jù)CsDXS1全長 cDNA 序列設計熒光定量 PCR 引物（表1）。以茶樹 GAPDH 作為內(nèi)參基因，檢測CsDXS1在茶樹不同組織部位以及不同激素處理條件下的相對表達量變化。熒光定量反應體系為：5×TRUE RT MasterMix 4 μL、上下游引物（10 μmol/L）各 0.8 μL、ROX Dye II 0.4 μL、cDNA 2 μL，加水至終體積 20 μL。反應程序為：94℃預變性 3 min；94℃預變性20 s，60℃退火 20 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)。每份樣品設置4個技術(shù)性重復，采用2-ΔΔCT方法分析基因的表達水平。利用 SPSS Statistics 19 軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗（P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 茶樹CsDXS1基因的克隆

對擴增片段進行測序拼接后得到的 ORF 全長序列為 2 154 bp，編碼 717 個氨基酸，具有兩個轉(zhuǎn)酮醇酶功能位點（圖1）。

2.2 茶樹CsDXS1的生物信息學分析

將茶樹CsDXS1氨基酸序列進行 BlastP 同源比對，結(jié)果（圖2）顯示茶樹CsDXS1蛋白與葡萄、楊樹、橡膠、可可、蓖麻、胡桃等多個物種的DXS蛋白的相似性都在85%以上，其中與葡萄DXS蛋白的相似性高達90%，說明茶樹CsDXS1蛋白在進化過程中的保守性強。從同源比對結(jié)果中還可以看出不同植物DXS氨基酸序列差異主要來源于 N 端的 1-60 個氨基酸，許多植物 DXS蛋白的N端普遍具有一段由幾十個氨基酸組成的質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽序列［8］，恰好包含于這段保守性弱的N端序列中。但是茶樹 CsDXS1蛋白并沒有預測到可能存在質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽序列。為進一步研究茶樹CsDXS1基因在DXS家族中的聚類關(guān)系，將茶樹CsDXS1蛋白與其他植物的DXS蛋白進行聚類分析，結(jié)果（圖3）表明茶樹CsDXS1蛋白與沉香、擬南芥、甜葉菊等植物的DXS1蛋白聚為一類，且與木本植物紅木以及沉香的DXS蛋白的親緣關(guān)系最近；蒺藜苜蓿、雷公藤、煙草等植物的DXS2聚為一類；而擬南芥DXS3同南非醉茄DXS在一個新的大分支。

經(jīng) ExPASy-ProtParam 分析預測，茶樹CsDXS1蛋白的分子量為 77.48 kD，理論等電點為 7.4，氨基酸組成中丙氨酸（Ala）、谷氨酸（Glu）、亮氨酸（Leu）、纈氨酸（Val）的比例較高，分別為 9.5%、9.5% 和 9.6%，可能與CsDXS1的功能結(jié)構(gòu)和酶學特性有關(guān)。茶樹CsDXS1蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)達到了41.94，表明該蛋白的性質(zhì)不是很穩(wěn)定?？偲骄杷禂?shù)為 -0.090，結(jié)合 ProtScale 在線工具的親水性/疏水性的預測結(jié)果（圖 4），顯示茶樹CsDXS1蛋白的N 端前部分序列表現(xiàn)出明顯的疏水性，而且整體的趨勢是越靠近 N 端，疏水性氨基酸的比例越高，而越靠近 C 端，親水性氨基酸的比例更高，其中疏水性和親水性最強的位點分別是第 64 位和 707 位，這很可能與茶樹CsDXS1蛋白在細胞中的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)。茶樹CsDXS1蛋白整體趨向于親水性質(zhì)。運用NetPhos3.1 server 分析和預測蛋白的磷酸化位點，結(jié)果表明茶樹CsDXS1蛋白中共有 15 個可信度高的磷酸化位點，預測值均大于 0.9，其中包含絲氨酸（Ser）磷酸化位點有 11 個，蘇氨酸（Thr）和絡氨酸（Tyr）的磷酸化位點各 2 個。這些可信度高的磷酸化位點都沒有特定的修飾激酶，說明很可能茶樹CsDXS1蛋白不僅有較多的磷酸化位點而且修飾類型豐富，這可能與茶樹CsDXS1蛋白的調(diào)控方式有關(guān)。

圖 1 茶樹 CsDXS1基因的 ORF 及其推導的氨基酸序列

綜合 C 值、Y 值、S 值的取值可以較為確切地反映信號肽的信息，從圖 5 中可見茶樹CsDXS1蛋白的預測結(jié)果中信號肽可能位點的3個值都低于0.2，說明其不存在信號肽位點，屬于非分泌蛋白?？缒そY(jié)構(gòu)域的預測結(jié)果（圖 6）顯示，茶樹CsDXS1蛋白的整個序列都在膜外，說明該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，不是跨膜蛋白。

運用 NCBI 上的 CCD 在線工具分析茶樹 DXS 蛋白的保守域，結(jié)果（圖 7）顯示CsDXS1蛋白含有典型的轉(zhuǎn)酮醇酶的保守域，是轉(zhuǎn)酮醇酶亞家族中的一類基因，說明茶樹CsDXS1蛋白與轉(zhuǎn)酮醇酶可能具有相似的功能，而且兩者的進化過程密切相關(guān)。結(jié)合在線工具 Prosite 對蛋白質(zhì)功能位點的預測分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)茶樹CsDXS1蛋白中含有兩段轉(zhuǎn)酮醇酶的特征序列（圖 1），其中一段位于靠近 N 端的位置，含有一個組氨酸殘基，可能在酶催化過程中負責質(zhì)子轉(zhuǎn)移；另一端序列比較靠近中間部位，包含保守的酸性氨基酸殘基，形成蛋白質(zhì)中的活性裂縫，很可能與底物結(jié)合有關(guān)。

圖 2 茶樹CsDXS1蛋白的多序列比對

圖 3 植物 DXS 家族的系統(tǒng)發(fā)育分析

圖 4 茶樹CsDXS1親水性和疏水性的預測

圖 5 茶樹CsDXS1氨基酸序列的信號肽分析結(jié)果

圖 6 茶樹CsDXS1跨膜結(jié)構(gòu)域分析與預測

2.3 茶樹CsDXS1基因的表達特征研究

2.3.1 茶樹 CsDXS1基因在不同組織中的表達分析 實時熒光定量 PCR 檢測顯示（圖 8），茶樹CsDXS1基因在不同組織中的表達豐度差異很大。CsDXS1 在第三葉中的表達量最高，隨著葉片的發(fā)育，其表達量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。CsDXS1 在幼嫩葉片中的表達量顯著高于成熟葉片、嫩莖和老莖，在第三葉中的表達量分別是老葉、嫩莖和老莖中的4.1 倍、3.4 倍和 3.6 倍。在不同組織中CsDXS1基因的表達水平從高到低依次為：第三葉＞第四葉＞第二葉＞第一葉＞嫩莖＞老莖＞老葉。

2.3.2 茶樹CsDXS1基因在不同激素處理下的表達分析 用水楊酸、赤霉素、茉莉酸甲酯、乙烯、脫落酸、吲哚乙酸 6 種激素分別處理無病蟲害、狀態(tài)良好且比較一致的福鼎大白茶植株，并在處理后 0（CK）、2、4、8和 24 h 分別采集茶樹葉片提取 RNA，利用實時定量 PCR 分析CsDXS1基因?qū)Σ煌に氐捻憫Ｊ健＝Y(jié)果（圖9）顯示，CsDXS1 基因在不同激素處理條件下的表達模式有很大的不同。用 1 mmol/L SA和 1 mmol/L ETH 處理后，CsDXS1 基因表達呈現(xiàn)出上升-下降-上升的趨勢，并在處理后 2 h 表達量達到最高，分別為 CK 表達量的 1.3 倍和 1.2 倍。用1 mmol/L IAA、0.1 mmol/L ABA 處理后的表達模式與SA 和 ETH 處理后的表達模式相似，但卻在 4 h 處理后表達量達到最大，均為 CK 表達量的 1.5 倍。在 1 mmol/L MEJA 處理下CsDXS1基因的呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，在 24 h 表達量達到最高，僅為 CK 的 1.1倍；在 1 mmol/L GA3處理下的表達模式與 MEJA 處理下的表達模式完全相反，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在 4 h 處理后表達量達到最大，為 CK 表達量的1.3 倍。

圖 7 茶樹CsDXS1的功能結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果

圖 8 CsDXS1基因在茶樹不同組織中的表達分析

3 討論

萜類是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的化學物質(zhì)，以異戊二烯（Isoprene）為骨架。由異戊二烯為單位構(gòu)成的類萜化合物，是迄今發(fā)現(xiàn)在功能和結(jié)構(gòu)上種類最多、分布最廣泛的一類植物代謝物，已鑒定出上萬個。DXS 在萜類化合物合成質(zhì)體途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用，催化丙酮酸和 3-磷酸-甘油醛發(fā)生縮合反應形成 MEP 途徑中的重要前體物質(zhì) DXP［9］，因此該反應是前體 IPP 與 DMAPP 的 MEP 合成途徑中的限速反應，同時該反應會影響植物中萜類化合物的含量［10］。Battilana 等［11］通過 QTL 定位發(fā)現(xiàn) DXS 基因是影響葡萄中單萜含量的主要位點。在擬南芥中過表達 DXS 基因會顯著增加轉(zhuǎn)基因植株中類胡蘿卜素、維生素 E、脫落酸和赤霉素等萜類物質(zhì)的含量［12］，而將擬南芥中的 DXS 基因在寬葉薰衣草中過量表達后，其葉片和花中單萜及倍半萜類揮發(fā)油含量也大幅的提高［13］。超量表達 DXS 同樣能夠顯著增加長春花中萜類物質(zhì)的積累［14］。在油棕和番茄果實中，萜類物質(zhì)類胡蘿卜素含量與 DXS 基因的表達量一致［15-17］。上述的研究結(jié)果均表明，DXS 是 MEP 途徑的關(guān)鍵酶，其活性的有無及高低與萜類成分的積累量有著直接的關(guān)系。茶樹是重要的葉用經(jīng)濟植物，其葉片含有大量的萜類物質(zhì)，其中揮發(fā)性萜類化合物是茶葉香氣的重要組成成分，因此 DXS 對茶葉品質(zhì)成分中萜類化合物的合成具有極其重要的意義。

圖 9 CsDXS1基因在茶樹不同激素處理下的表達分析

劉晶晶等［18］針對不同發(fā)育階段鮮葉的氣相色譜和質(zhì)譜分析表明，茶樹葉片萜類化合物含量受到葉片發(fā)育階段影響，表現(xiàn)為幼葉中多，老葉中少。茶樹不同組織中的定量表達數(shù)據(jù)表明，CsDXS1 基因的表達水平在第三葉中表達量最高，在幼葉中的表達水平顯著高于老葉、嫩莖和老莖。推測CsDXS1基因存在組織特異性，在幼葉中的表達較高。這說明本研究中CsDXS1基因的表達模式與萜類化合物的積累模式十分一致。植物 DXS 蛋白的聚類分析表明，茶樹CsDXS1基因?qū)儆?DXS 家族的 I 類基因，結(jié)合前期茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的結(jié)果，推測茶樹可能至少含有 2 個 DXS 基因，這與已有研究發(fā)現(xiàn)玉米［19］、水稻［20］中有多個 DXS 基因的結(jié)果相一致。DXS 的生理生化功能與其組織表達特性密切相關(guān)。對辣椒［21］中兩個轉(zhuǎn)酮醇酶編碼基因的表達分析以及油棕［15］DXS 基因的研究發(fā)現(xiàn)，不同 DXS 基因的表達量以及相應的萜類物質(zhì)含量在果實發(fā)育過程中具有明顯變化，DXS 基因家族不同成員基因的時空表達模式也在玉米等模式植物中得到了詳細的闡明［22］。本研究中得到的CsDXS1表達量在幼嫩葉片中的表達量顯著高于其他組織，結(jié)合上述 DXS 基因的組織表達特性以及茶樹萜類物質(zhì)的積累特點，推測其可能在葉片萜類物質(zhì)的合成中發(fā)揮了十分重要的作用。

植物激素不僅能夠影響茶樹生長，還使得茶樹內(nèi)含物質(zhì)發(fā)生變化，其主要通過信號轉(zhuǎn)導啟動或調(diào)控下游相關(guān)基因的表達來發(fā)揮其作用［23］。已有研究表明 GA 處理能夠顯著提高茶樹中包括香氣在內(nèi)的成茶品質(zhì)［24］。定量結(jié)果表明，在外源 GA 的處理下，CsDXS1 的表達水平在短時間內(nèi)被誘導并顯著上調(diào)表達。而CsDXS1基因在外源 IAA 和 ETH 的處理下也呈現(xiàn)出相似的趨勢。我們推測CsDXS1基因可能在激素顯著提高茶樹香氣品質(zhì)的過程中發(fā)揮了一定的作用。不同程度的非生物脅迫和生物脅迫等防御作用是影響萜類物質(zhì)合成的主要因素。赤松［25］DXS 的研究中發(fā)現(xiàn)植株莖表的傷口會導致 DXS 基因表達量的升高以及萜類物質(zhì)含量的上升。Cho 等［26］研究發(fā)現(xiàn)臺灣烏龍茶“東方美人茶”鮮葉只有經(jīng)過小綠葉蟬吸食后，方可導致不同應激蛋白基因表達并正調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄編碼，促使葉內(nèi)各種揮發(fā)性萜類物質(zhì)的形成。茶樹在正常生長環(huán)境條件下，體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡，葉片自身含有的萜類物質(zhì)種類和含量較少，當處于逆境脅迫時，動態(tài)平衡遭到破壞，萜類物質(zhì)大量合成與增加［27］。ABA、SA、MEJA 等物質(zhì)已被證明在植物非生物脅迫和生物脅迫等防御過程中發(fā)揮重要的作用。在 ABA 和SA 的處理下，CsDXS1 的表達水平均在短時間內(nèi)被誘導并顯著上調(diào)表達。已有報道表明，ABA 和 SA能夠協(xié)同誘導植物產(chǎn)生抗逆性，抵制不良因素造成的傷害［28］。我們推測，ABA 和 SA 可能通過提高CsDXS1的表達水平，影響萜類物質(zhì)的合成，進而提高其抗性。而在 MEJA 的誘導下，CsDXS1 表達水平與 SA 和 ABA 呈現(xiàn)相反的趨勢，推測其調(diào)控CsDXS1表達水平的機理與二者不同。

4 結(jié)論

茶樹CsDXS1基因含有長為 2 154 bp 的開放讀碼框，編碼 717 個氨基酸殘基。茶樹CsDXS1與已知葡萄和楊樹的 DXS 序列相似性最高。qRT-PCR 分析表明，CsDXS1基因在茶樹嫩葉中的表達量最高，并受到多種激素的誘導。

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