張春蘭 滿麗莉 向殿軍 包烏日娜 劉鵬

（1. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，通遼 028042；2. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，通遼 028042）

干旱、高鹽和低溫是植物頻繁遭受的主要非生物脅迫，在很大程度上限制植物時(shí)空分布，造成作物產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降，嚴(yán)重時(shí)甚至絕收［1-3］。植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成了一系列應(yīng)答保護(hù)機(jī)制去忍受或適應(yīng)各種極端環(huán)境條件［3-4］。通過(guò)特異的信號(hào)傳導(dǎo)通路感知非生物脅迫，植物啟動(dòng)相關(guān)脅迫基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的各種新陳代謝反應(yīng)去適應(yīng)逆境脅迫。其中，蔗糖非發(fā)酵相關(guān)的蛋白激酶（Sucrose non-fermenting-1-related protein kinase，SnRK）調(diào)控靶蛋白的可逆磷酸化修飾在這一系列防御機(jī)制過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

SnRK2蛋白激酶成員通過(guò)ABA非依賴和ABA依賴的兩種調(diào)節(jié)途徑參與滲透脅迫信號(hào)通路。擬南芥10個(gè)SnRK2成員中，有9個(gè)（除AtSnRK2.9外）能響應(yīng)NaCl和甘露醇脅迫，但只有AtSnRK2.2、AtSnRK2.3、AtSnRK2.6、AtSnRK2.7和 AtSnRK2.8五個(gè)成員參與ABA應(yīng)答反應(yīng)［5］。類似地，水稻10個(gè)SnRK2成員均能響應(yīng)NaCl脅迫，但僅有3個(gè)成員（SAPK8、SAPK9 和 SAPK10）能應(yīng)答 ABA 脅迫［6］。現(xiàn)在對(duì)于SnRK2非依賴ABA調(diào)控通路的研究還不太深入，而對(duì)ABA依賴信號(hào)通路的研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展。高鹽、干旱等逆境脅迫能導(dǎo)致植物內(nèi)源激素ABA大量合成，植物細(xì)胞膜上的含有START結(jié)構(gòu)域的受體（PYR/PYL/RCAR）能感受ABA含量的變化［7］。細(xì)胞內(nèi)缺少ABA時(shí)，PP2C會(huì)抑制依賴ABA調(diào)控通路中SnRK2蛋白激酶活性；相反，細(xì)胞產(chǎn)生ABA時(shí)，PP2C的活性則被PYR/PYL/RCAR受體與ABA結(jié)合形成的復(fù)合體所抑制，SnRK2蛋白激酶得以釋放［7-8］。所以，SnRK2可通過(guò)ABA非依賴通路直接作用于相關(guān)基因，開(kāi)啟一系列脅迫響應(yīng)基因表達(dá)；也可通過(guò)ABA依賴通路調(diào)節(jié)下游底物的活性來(lái)激活相關(guān)脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)。SnRK2作用的底物至少有58個(gè)，涉及表型遺傳調(diào)控、RNA拼接、離子通道、ROS穩(wěn)定和葉綠體過(guò)程等多種生物過(guò)程［9］。SnRK2可通過(guò)SnRK2-AREB/ABF調(diào)控通路引發(fā)一系列ABA應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄。ABA應(yīng)答基因的啟動(dòng)子上含有多個(gè)保守的響應(yīng)ABA的順式作用元件ABRE，SnRK2蛋白激酶可以磷酸化轉(zhuǎn)錄因子如ABRE/AREB/bZIP，活性被磷酸化調(diào)節(jié)的反式因子隨后與ABRE順式作用元件結(jié)合，啟動(dòng)ABA響應(yīng)基因的表達(dá)［10，11］。

菘藍(lán)（Isatis tinctoria L.）作為一種重要的中藥資源，其有效成分是它的次生代謝產(chǎn)物靛玉紅。由于非生物脅迫會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的次生代謝產(chǎn)物，所以靛玉紅生成和累積與菘藍(lán)忍受或適應(yīng)非生物脅迫的分子應(yīng)答機(jī)制存在某種相關(guān)性。菘藍(lán)具有很強(qiáng)的抵御環(huán)境脅迫的能力，包含眾多的優(yōu)良性狀及抗逆基因源。但是，相對(duì)于其它十字花科蔬菜，對(duì)菘藍(lán)抵抗逆境脅迫的研究較少，到目前為止，還未見(jiàn)有對(duì)SnRK2蛋白激酶成員的研究與報(bào)道。本研究基于同源克隆的方法，從菘藍(lán)中分離了一個(gè)SnRK2成員，對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、系統(tǒng)發(fā)生等進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。同時(shí)，利用實(shí)時(shí)定量PCR分析了菘藍(lán)SnRK2基因的組織表達(dá)模式和脅迫表達(dá)模式。本研究期望對(duì)菘藍(lán)SnRK2基因的抗逆功能研究提供理論依據(jù)，為揭示菘藍(lán)抗逆機(jī)制以及有效成分的積累奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的菘藍(lán)種子購(gòu)于邁格威農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司。將菘藍(lán)種子用70%乙醇處理殺菌，用水漂洗幾次后播種到土壤中，培養(yǎng)溫度為26℃，光照強(qiáng)度2 000 Lx，光照16 h/d。選取30 d苗齡的菘藍(lán)種子幼苗進(jìn)行高鹽脅迫處理（200 mmol/L NaCl）、干旱脅迫處理（10% PEG6000）和ABA脅迫處理（100 μmol/L ABA），以無(wú)離子水處理的菘藍(lán)幼苗作為對(duì)照。收集對(duì)照幼苗的全株用于基因克隆。分別收集對(duì)照幼苗的根、莖和葉組織用作基因組織表達(dá)模式分析。分別收取脅迫處理前（0 h）和脅迫處理后1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 和 72 h的菘藍(lán)葉片用于基因脅迫表達(dá)模式分析。樣品經(jīng)液氮速凍后，置于-70℃冰箱保存，用于總RNA制備。

1.2 方法

1.2.1 ItSnRK2.1基因克隆 以擬南芥AtSnRK2.1 mRNA序列（NM _120946.5）作為檢索序列，進(jìn)行Nucleotide BLAST，下載以下7條代表性序列：At-SnRK2.1（NM_120946.5）、AlSRK2G（XM_0028713-03.2）、CsSRK2G（XM_010424744.2）、BrSRK2G（XM_009132845.2）、BoSRK2G（XM_013773862.1）、

SRK2G（XM_018591452.1） 和 BnSRK2G（XM_013-824876.1），多序列比對(duì)后，在保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物（5'-GGRTYTCACCAKCTCNTCTTCTTAT-3' 和 5'-TAGTTTACMGCBTWTGGCTTTGACA-3'）。總RNA提取按照TaKaRa公司MiniBEST Plant RNA Extraction Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。第一鏈 cDNA合成：在冰浴的RNase Free離心管中加入3 μg總RNA，1 μL Random 6 mers（50 μmol/L），1 μL dNTP Mixture（10 mmol/L），加 RNase free ddH2O 至 10 μL，65℃保溫5 min，迅速冰浴5 min，短暫離心后，向管中加入 4 μL 5×PrimeScript Buffer，0.5 μL RNase Inhibitor（40 U/μL），1 μL PrimeScript RTase（200 U/μL）， 加RNase free ddH2O至20 μL，混勻后，30℃保溫10 min，42℃ 30 min，95℃保溫5 min后迅速至冰上冷卻。以第一鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：2 μL 1st-Strand cDNA 溶 液，4 μL dNTP Mixture（ 各2.5 mmol/L），1 μL 上游兼并引物（10 μmol/L），1 μL下游兼并引物（10 μmol/L），10 μL 5×Prime STAR Buffer（Mg2+Plus），0.5 μL Prime STAR HS DNA Polymerase（2.5 U/μL），31.5 μL ddH2O。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 4 min ；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，32 個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、末端加A和純化后克隆至T-Vector pMD20（TaKaRa公司）上進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 ItSnRK2.1基因的生物信息學(xué)分析 基因的編碼區(qū)的預(yù)測(cè)、序列提交、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析， 分 別 采 用 ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）、Bankit（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/WebSub/?tool=genbank） 和ProtParam tool（http://web.expasy.org/protparam/）在線程序完成。利用 ScanProsite（http://prosite.expasy.org/scanprosite/）、TMpred Server（http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）、NetPhos 3.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）、ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/）、SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）、SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線程序分別對(duì)ItSnRK2.1蛋白進(jìn)行保守功能域、跨膜區(qū)、磷酸化位點(diǎn)、親水性/疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽分析預(yù)測(cè)。Blastp搜索與ItSnRK2.1同源的蛋白序列，基于MEGA5.0軟件以鄰近法完成蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，利用GENEDOC軟件生成蛋白多序列比對(duì)?；虮磉_(dá)水平采用Miura等［12］方法進(jìn)行分析。

1.2.3 ItSnRK2.1基因的實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè) 利用TaKaRa公司PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）合成cDNA第一鏈。

參照TaKaRa公司SYBR? Fast qPCR Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)ItSnRK2.1基因表達(dá)模式。ItSnRK2.1基因特異性引物為5'-GGAGTATGCTTCTGGAGGAG-3'和5'-GAGCAGGGCTCCCATCAAGC-3'。用Itactin（AY870652）作為持家基因，擴(kuò)增引物為5'-ATTCCGTTGCCCTGAAATAC-3'和5'-CTTTGCTCATACGGTCAGCG-3'。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 30 s；94℃ 5 s，60℃ 10 s，40 個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 菘藍(lán)ItSnRK2.1基因的克隆

菘藍(lán)幼苗的總RNA提取結(jié)果（圖1-A）顯示，所提取的總RNA 5S、18S和28S條帶較完整和清晰，可以用于合成cDNA第一鏈的模板。以第一鏈cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，產(chǎn)生1 300 bp左右的的特異性片段（圖1-B）。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序得到1 305 bp cDNA序列。ORF Finder預(yù)測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，1305 bp 的cDNA具有一個(gè)112 bp 的3'-非編碼區(qū)（3'-UTR），一個(gè)1 071 bp的開(kāi)放閱讀框（ORF）和一個(gè)122 bp 的5'-非編碼區(qū)（5'-UTR），編碼356個(gè)氨基酸。將該cDNA全長(zhǎng)序列命名為ItSnRK2.1，提交至Genbank，獲得登錄號(hào)為MF423122。

圖1 總RNA的提取和ItSnRK2.1基因的RT-PCR擴(kuò)增

圖2 ItSnRK2.1基因cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列

2.2 菘藍(lán)ItSnRK2.1蛋白激酶的氨基酸組成和理化性質(zhì)分析

ItSnRK2.1全長(zhǎng)cDNA編碼356 aa，理論等電點(diǎn)為5.64，理論分子量為40.6 kD；ItSnRK2.1蛋白中Glu、Lys、Ser和Leu含量較高，分別為10.4%、7.9%、7.9%和7.6%；ItSnRK2.1蛋白中帶負(fù)電荷的殘基（Asp+Glu）總數(shù)為58個(gè)，帶正荷的殘基（Arg+Lys）總數(shù)為47個(gè)；ItSnRK2.1蛋白分子式為C1791H2823N489O555S15，平均疏水性（GRAVY）為-0.515，脂肪氨基酸指數(shù)（AI）為82.16。ItSnRK2.1蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為44.94，屬于不穩(wěn)定蛋白，與擬南芥AtSnRK2.1蛋白激酶的氨基酸組成極為相似。

2.3 ItSnRK2.1蛋白激酶的多序列比對(duì)和進(jìn)化分析

為了明確ItSnRK2.1蛋白激酶的結(jié)構(gòu)特征，對(duì)推導(dǎo)的ItSnRK2.1蛋白激酶的氨基酸序列同擬南芥、水稻、大麥、玉米、水稻、燕麥和二穗短柄草的SnRK2氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)和ScanProsite在線預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，ItSnRK2.1蛋白包含一個(gè)由酸性氨基酸序列組成的高度特異的C端激酶調(diào)控域及一個(gè)高度保守的N端蛋白激酶催化域（圖3-A）。ItSnRK2.1蛋白高度保守的N端催化域（4-260 aa）具有一個(gè)24 aa的ATP結(jié)合位點(diǎn)（圖3-B，黑框I）和一個(gè)13 aa的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶激活位點(diǎn)（圖3-B，黑框II）。C端包含一個(gè)34 aa的結(jié)構(gòu)域I（Domain I）（圖3-B，黑框III）。但是，同AtSnRK2.1蛋白激酶相同，C端缺少44 aa的結(jié)構(gòu)域II（Domain II）（圖 3-B，黑框Ⅳ）。

多序列比對(duì)結(jié)果（圖3-B）顯示，ItSnRK2.1蛋白與其它8個(gè)SnRK2成員高度同源。ItSnRK2.1氨基酸序列與擬南芥AtSnRK2.1（NP_196476.1）、水 稻 OsSAPK7（BAD18003.1）、 大 麥 HvPKABA1（BAB61735.1）、擬南芥 AtSnRK2.6（NP_567945.1）、玉 米 ZmSnRK2.1（ACG50005.1）、 水 稻 OsSAPK2（BAD17998.1）、燕麥 TaSnRK2.8（AKZ18234.1）和二穗短柄草 BdSAPK8（AJR27164.1）氨基酸序列的相似性分別為95.18%、74.16%、66.67%、64.33%、64.91%、65.50%、62.92%和62.90%。

為了明確ItSnRK2.1與其它nRK2蛋白激酶的進(jìn)化關(guān)系，用菘藍(lán)、水稻、玉米、燕麥等30個(gè)SnRK2成員的氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果（圖4）顯示，30個(gè)SnRK2.1蛋白激酶可以分為3組，菘藍(lán)ItSnRK2.1蛋白激酶同擬南芥AtSnRK2.1、馬鈴薯StSnRK2.4、玉米ZmSnRK2.6、水稻OsSAPK7等12個(gè)SnRK2成員聚為一組，說(shuō)明這些基因在進(jìn)化上高度保守，可能在抗逆功能上具有相似性。

2.4 ItSnRK2.1蛋白激酶的疏水性分析

氨基酸的親水性和疏水性是蛋白質(zhì)固有的特征，氨基酸的親水性和疏水性之間的平衡決定著蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征，而氨基酸內(nèi)的疏水作用在很大程度上決定著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。所以，分析和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的親水性和疏水性可以為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測(cè)提供重要的理論依據(jù)。氨基酸的親水性和疏水性分析結(jié)果（圖5）顯示，ItSnRK2.1蛋白激酶最大疏水性氨基酸值為2.189，最小疏水性氨基酸值為-3.300，存在多個(gè)明顯的親水區(qū)域，而且組成ItSnRK2.1蛋白激酶的大部分的氨基酸屬于親水性氨基酸。據(jù)此推斷，菘藍(lán)ItSnRK2.1蛋白激酶屬于親水性蛋白。

圖3 ItSnRK2.1蛋白激酶保守結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和多序列比對(duì)

圖4 ItSnRK2.1蛋白聚類分析

2.5 ItSnRK2.1蛋白激酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果（圖6）顯示，菘藍(lán)ItSnRK2.1蛋白激酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有151個(gè)α-螺旋（Alpha helix）、109個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲（Random coil）、66個(gè)延伸鏈（Extended strand）和30個(gè)β-轉(zhuǎn)角（Beta turn）。與擬南芥AtSnRK2.1蛋白激酶的155個(gè)α-螺旋（Alpha helix）、109個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲（Random coil）、62個(gè)延伸鏈（Extended strand）和27個(gè)β-轉(zhuǎn)角（Beta turn）極為相似，暗示菘藍(lán)ItSnRK2.1蛋白激酶可能與擬南芥AtSnRK2.1蛋白激酶可能具有相似的功能。

2.6 ItSnRK2.1信號(hào)肽的預(yù)測(cè)和分析

信號(hào)肽是由長(zhǎng)度5-30個(gè)N-末端氨基酸組成的短肽鏈（有時(shí)不一定在N端），其功能是引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移。利用SignalP 4.1 Server對(duì)ItSnRK2.1進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果（圖7）顯示，可能沒(méi)有信號(hào)肽區(qū)域存在于ItSnRK2.1蛋白激酶中。

圖5 ItSnRK2.1蛋白激酶親水性/疏水性分析

2.7 ItSnRK2.1蛋白激酶的亞細(xì)胞定位

為了掌握菘藍(lán)ItSnRK2.1蛋白的表達(dá)和作用位置，利用在線預(yù)測(cè)軟件PSORT Prediction對(duì)ItSnRK2.1蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位。預(yù)測(cè)結(jié)果表明，ItSnRK2.1蛋白的可能定位在細(xì)胞質(zhì)（Cytoplasm）、微體（Microbody）、線粒體基質(zhì)空間（Mitochondrial matrix space）和溶酶體（Lysosome）上。這4個(gè)位置的決定性系數(shù)（Certainty）分別為0.450、0.300、0.100和0.100，所以推測(cè)ItSnRK2.1蛋白最可能定位的位置是在細(xì)胞質(zhì)上。

2.8 ItSnRK2.1蛋白激酶的的跨膜區(qū)分析

α-螺旋結(jié)構(gòu)通常作為蛋白質(zhì)序列中跨越細(xì)胞膜的區(qū)域，構(gòu)成跨膜區(qū)的氨基酸大部分必須是疏水性氨基酸，這樣才能使膜蛋白順利通過(guò)細(xì)胞膜的磷脂雙分子層。TMpred 預(yù)測(cè)結(jié)果（圖8）顯示，可能有3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域存在于ItSnRK2.1蛋白中。由外向內(nèi)的跨膜結(jié)構(gòu)域有一個(gè)，位于183-200 aa，長(zhǎng)度為18 aa，分?jǐn)?shù)為892。由內(nèi)向外的跨膜結(jié)構(gòu)域有二個(gè)：一個(gè)位于98-121 aa，長(zhǎng)度為24 aa，分?jǐn)?shù)為182；另一個(gè)位于183-200 aa，長(zhǎng)度為18 aa，分?jǐn)?shù)為1 109。所以，ItSnRK2.1蛋白激酶可能存在2個(gè)顯著跨膜結(jié)構(gòu)域（分?jǐn)?shù)大于500）。

2.9 ItSnRK2.1蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)分析

大部分前體蛋白需要經(jīng)過(guò)翻譯后修飾才能成為有功能的蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)翻譯后修飾中最重要、最常見(jiàn)的方式之一是蛋白質(zhì)的磷酸化。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果（圖9）顯示，ItSnRK2.1蛋白激酶可能有8個(gè)酪氨酸（Tyr），11個(gè)蘇氨酸（Thr），23個(gè)絲氨酸（Ser）成為磷酸化位點(diǎn)。擬南芥AtSnRK2.1蛋白激酶可能有7個(gè)酪氨酸（Tyr），10個(gè)蘇氨酸（Thr），21個(gè)絲氨酸（Ser）成為磷酸化位點(diǎn)。二者可能的磷酸化位點(diǎn)的數(shù)目和位置極為相似，它們可能具有類似的磷酸化過(guò)程。

2.10 ItSnRK2.1基因表達(dá)分析

2.10.1 ItSnRK2.1基因組織表達(dá)特性 為了探明ItSnRK2.1基因在雪菜根、莖和葉組織中的表達(dá)模式，利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR對(duì)ItSnRK2.1基因的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行了分析。檢測(cè)結(jié)果（圖10）顯示，在3個(gè)供試組織中都能檢測(cè)到ItSnRK2.1基因的表達(dá)，但基因表達(dá)水平在不同組織中存在一定差異。ItSnRK2.1基因表達(dá)量最高的組織是根，其次為葉片，表達(dá)量最低的組織是莖，說(shuō)明ItSnRK2.1基因的表達(dá)具有組織特異性。

2.10.2 ItSnRK2.1基因脅迫表達(dá)特性 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果（圖11）顯示，ItSnRK2.1基因積極參與高鹽和干旱脅迫應(yīng)答反應(yīng)。當(dāng)菘藍(lán)幼苗受到高鹽脅迫時(shí)，ItSnRK2.1基因表達(dá)量迅速上升，在脅迫3 h時(shí)，表達(dá)量達(dá)到最高，為處理前（0 h）的4.8倍，隨后表達(dá)量逐漸降低，72 h時(shí)表達(dá)量?jī)H為對(duì)照的1.3倍（圖11-A）。當(dāng)菘藍(lán)幼苗遭受PEG脅迫時(shí)，ItSnRK2.1基因表達(dá)量也呈現(xiàn)出先升高、后下降的表達(dá)規(guī)律，但出現(xiàn)兩個(gè)波峰值，分別出現(xiàn)在3 h時(shí)和12 h時(shí)，表達(dá)量分別是對(duì)照的2.2和2.3倍（圖11-B）。當(dāng)用ABA處理菘藍(lán)幼苗時(shí)，各時(shí)間段ItSnRK2.1基因表達(dá)水平無(wú)明顯差異（圖11-C），類似于去離子水（對(duì)照）處理（圖11-D）。

圖6 ItSnRK2.1同AtSnRK2E二級(jí)結(jié)構(gòu)比較

圖7 ItSnRK2.1蛋白信號(hào)肽的預(yù)測(cè)

圖8 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

圖9 ItSnRK2.1蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

圖10 ItSnRK2.1基因的的組織表達(dá)分析

3 討論

SnRK2家族基因編碼植物體內(nèi)特有的參與多種信號(hào)傳導(dǎo)的一類Ser/Thr蛋白激酶，是影響植物抗逆境脅迫能力的關(guān)鍵調(diào)控基因，其在不同脅迫下和不同組織中的表達(dá)具有一定的差異性。實(shí)時(shí)定量和半定量分析結(jié)果顯示，煙草NtSnRK2.1基因在根部有最高表達(dá)水平，葉片中的次之，莖部的表達(dá)量最低［14］。Northern blot檢測(cè)結(jié)果表明，在 ABA、NaCl和甘露醇脅迫下，水稻基因組中10個(gè)SnRK2成員（SAPK1-SAPK10）在根、葉鞘和葉片不同組織中的表達(dá)存在差異性［6］。本研究發(fā)現(xiàn)ItSnRK2.1基因的表達(dá)也具有一定的組織差異性，與水稻和煙草中的組織表達(dá)模式基本一致。

多序列比對(duì)結(jié)果顯示，不同SnRK2蛋白激酶成員在N末端高度保守，而在C末端高度特異。SnRK2家族成員在C末端包含一個(gè)酸性補(bǔ)丁（D/E），一般富含天冬氨酸（D）或谷氨酸（E），依據(jù)這一特點(diǎn)將SnRK2成員分為二組：SnRK2a（酸性補(bǔ)丁中富含D）和 SnRK2b（酸性補(bǔ)丁中富含E）［15］。序列分析顯示，菘藍(lán)ItSnRK2.1蛋白的C末端也包含一個(gè)谷氨酸（E）的酸性補(bǔ)丁，因此，ItSnRK2.1屬于SnRK2b家族中的一員。基于C末端結(jié)構(gòu)組成和系統(tǒng)發(fā)生，又可將SnRK2家族成員分為3組：Group I-Group III［16］。進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建結(jié)果表明，菘藍(lán)ItSnRK2.1被歸為Group I成員，這與Group II和Group III屬于SnRK2a，而Group I屬于SnRK2b的研究結(jié)果一致。SnRK2蛋白激酶家族的C末端主要包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：一個(gè)是Domain I，該區(qū)域是SnRK2蛋白激酶響應(yīng)非生物脅迫的必要元件，Group I-Group III成員都具備這一結(jié)構(gòu)域；另一個(gè)是Domain II，為Group III成員所特有的一段序列，是響應(yīng)ABA應(yīng)答不可缺

少元件，在與PP2C、ABI1等磷酸酶的互作及響應(yīng)ABA 應(yīng)答等方面發(fā)揮著重要的作用［6，13，17-18］。除SnRK2.9外，擬南芥其余9個(gè)SnRK2成員都響應(yīng)高滲脅迫，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)Group I成員不響應(yīng)ABA脅迫，Group II成員對(duì)ABA脅迫不響應(yīng)或具有微弱的響應(yīng)，Group III成員強(qiáng)烈響應(yīng) ABA 脅迫［5，10，16］。10 個(gè)水稻SnRK2成員也都響應(yīng)高滲脅迫，其中Group I和Group II中的3個(gè)成員（SAPK8、SAPK9和SAPK10）也響應(yīng)ABA脅迫［6］。這些研究結(jié)果與SnRK2家族成員的高度保守的N端催化域和特異的C端激酶調(diào)控域是相關(guān)的，SnRK2家族成員在功能上的相似性與差異性、響應(yīng)脅迫的相似性與差異性等都可能歸因于SnRK2s序列的一致性和多樣性。與擬南芥AtSnRK2.1和水稻SAPK7的研究結(jié)果及其相似，菘藍(lán)ItSnRK2.1蛋白激酶的C末端僅含有一個(gè)34 aa的Domain I，缺少44 aa的Domain II，并且響應(yīng)高滲脅迫但對(duì)ABA脅迫不敏感，暗示菘藍(lán)ItSnRK2.1基因與擬南芥AtSnRK2.1和水稻SAPK7有類似的功能，在參與非生物脅迫過(guò)程中很可能也是不依賴ABA調(diào)控通路的。

4 結(jié)論

從菘藍(lán)中克隆了1個(gè)編碼蔗糖非發(fā)酵相關(guān)的蛋白激酶的基因ItSnRK2.1，包含一個(gè)1 071 bp的完整開(kāi)放閱讀框，編碼356個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)為5.64，理論分子量為40.6 kD。

ItSnRK2.1蛋白激酶包含一個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸酶活結(jié)構(gòu)域。預(yù)測(cè)了ItSnRK2.1蛋白激酶的亞細(xì)胞定位、親水性/疏水性、信號(hào)肽、二級(jí)結(jié)構(gòu)、磷酸化位點(diǎn)和跨膜域。ItSnRK2.1氨基酸序列與其它SnRK2成員分享較高的相似性，同AtSnRK2.1、AtSnRK2.5和StSnRK2.6蛋白親緣關(guān)系最近，處在同一進(jìn)化分枝。ItSnRK2.1基因表達(dá)具有組織特異性，積極參與高鹽和干旱脅迫應(yīng)答反應(yīng)，但對(duì)ABA脅迫不敏感，表明該基因可能與植物抗逆境脅迫有關(guān)，且不依賴ABA調(diào)控通路。

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