王朱珺 王尚 劉洋熒 馮凱 鄧曄

（1. 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心中國科學院環(huán)境生物技術重點實驗室，北京 100085；2. 中國科學院大學資源與環(huán)境學院，北京 100049）

氮循環(huán)是生物地球化學循環(huán)的重要組成部分，現(xiàn)代氮循環(huán)幾乎全部依靠微生物介導的氧化還原反應完成（圖1），只有小部分依靠長期的地質循環(huán)［1-2］。微生物，包括細菌、古菌和真菌，在氮循環(huán)中起著不可替代的作用，它們之所以能夠實現(xiàn)氮素轉化是由于體內存在一系列氮代謝相關的酶。編碼這些酶的活性亞基的基因可作為相應微生物的功能標記基因［3］，通過分子檢測技術鑒定這些功能基因是我們了解環(huán)境中氮循環(huán)過程的重要手段和方法。

圖1 氮循環(huán)的各個生態(tài)過程及相關的功能基因

對參與氮循環(huán)的功能微生物的研究已有上百年歷史，編碼特定功能酶的功能基因不斷成功破譯，極大地拓展了對氮循環(huán)功能微生物的認識。尤其是近十幾年來宏基因組學技術的革新，促使氮循環(huán)相關研究出現(xiàn)了一系列令人矚目的成果，例如氨氧化古菌和完全硝化菌的發(fā)現(xiàn)更是顛覆了人們百年來對硝化作用的固有認識。早在19世紀，Winogradsky（1890年）分離的一株氨氧化菌便證明了細菌在硝化作用中發(fā)揮著作用，由此氨氧化細菌（AOB）被認為是氨氧化過程的主要參與者。直到2004年基于宏基因組學的研究發(fā)現(xiàn)，海洋古菌的基因組中含有與細菌類似的編碼氨單加氧酶的結構基因［4］；而次年從西雅圖水族館海水中分離培養(yǎng)得到第一株氨氧化古菌（AOA）［5］，至此徹底改變了學術界認為只有AOB進行氨氧化作用的傳統(tǒng)認識［6-7］。而2015年完全硝化菌成為了又一顛覆性發(fā)現(xiàn)，Daims等［8］和van Kessel等［9］對全球廣泛分布的硝化螺旋菌屬（Nitrospira）進行宏基因組高通量測序，發(fā)現(xiàn)這種化能自養(yǎng)菌擁有能夠編碼完成硝化作用將NH4+轉化為NO2-再轉化為NO3-的兩大步驟必需的所有酶，比常規(guī)的氨氧化微生物生長率更低而生長量更高。他們這一重大發(fā)現(xiàn)顛覆了一直以來認為硝化作用的兩大步驟不能被同一個微生物催化完成的固有觀念，完全硝化菌也因此成為了氮循環(huán)微生物的重要成員。在回顧氮循環(huán)研究發(fā)展的歷程中，我們發(fā)現(xiàn)在各個重要節(jié)點，功能基因分子檢測技術都起到了關鍵性作用。本文將簡要介紹PCR擴增技術、DNA指紋圖譜技術、穩(wěn)定性同位素示蹤技術、分子雜交技術、測序技術等分子檢測技術，重點論述其在氮循環(huán)功能微生物的群落多樣性方面的研究進展，最后指出分子檢測技術的革新和完善的數(shù)據(jù)分析平臺的建立對未來氮循環(huán)功能微生物研究的重要意義。

1 分子檢測技術的發(fā)展

準確測量微生物豐度是開展微生物生態(tài)學研究的基礎，但精確度量是一項具有挑戰(zhàn)的任務，而分子技術的革新使得更為精準的度量成為可能［10］。宏基因組分子檢測技術使用非培養(yǎng)的手段，通過環(huán)境樣品中所有微生物的DNA來獲得微生物群落遺傳信息，能夠更加全面、真實、精確地反映微生物群落的結構及潛在功能［11-12］。常用的分子檢測技術分為五大類：PCR擴增技術、DNA指紋圖譜技術、穩(wěn)定性同位素示蹤技術、分子雜交技術、測序技術（表1）。

常用的分子檢測技術中，基因芯片和高通量測序技術屬于高通量分子檢測技術，其他的技術通量較低。基因芯片技術通過一組已知核酸探針與環(huán)境樣品雜交進行核酸序列測定［11］。基因芯片包括系統(tǒng)發(fā)育芯片（PhyloChip）和功能基因芯片（GeoChip）［20］，系統(tǒng)發(fā)育芯片通過檢測特異性的16S rRNA等系統(tǒng)發(fā)育標記基因，反映不同物種在特定環(huán)境的分布情況；功能基因芯片通過檢測執(zhí)行特殊功能的功能基因，來反映在微生物群落中的功能類群的分布情況。高通量測序技術分為擴增子測序和宏基因組鳥槍測序。擴增子測序是針對目標基因，如16S rRNA基因展開測序，包括焦磷酸測序，Miseq和Hiseq等；鳥槍測序不針對特定目標基因，隨機地對環(huán)境樣品基因組展開測序［11］。

表1 常用分子檢測技術優(yōu)缺點對比

此外，單細胞測序技術首先利用單細胞分離技術將細胞分離成個體，然后針對單個細胞的基因組進行高通量測序分析，能夠揭示單個細胞的基因結構和基因表達狀態(tài)，獲取未培養(yǎng)微生物遺傳信息，在發(fā)掘環(huán)境“暗物質”方面有很好的應用前景［18-19］。細胞內融合 PCR 技術（Emulsion paired isolation and concatenation PCR，epicPCR）［21］是2016年發(fā)表的技術，該技術的優(yōu)勢是可在未培養(yǎng)的單細胞中將功能基因與系統(tǒng)發(fā)育標記基因（如16S rRNA基因）連接在一起，通量可達數(shù)十萬個細胞，而成本只與一個基因組文庫相當。

自1991年克隆文庫［22］應用于環(huán)境樣本研究開始，F(xiàn)ISH［23］、DGGE［24］、T-RFLP［25］、DNASIP［26］、qPCR［27］、基因芯片［28］、高通量測序［29-30］、單細胞測序［31-32］、epicPCR［21］這些分子檢測技術也相繼應用于環(huán)境樣本研究（圖2-A）。最早應用于環(huán)境氮循環(huán)功能微生物研究的分子檢測技術是克隆文庫［33］，始于 1997 年，隨后 FISH［34］、T-RFLP［35］、DGGE［36］、基因芯片［28］、qPCR［37］、DNA-SIP［38］、高通量測序［39］也相繼應用于環(huán)境樣本中氮循環(huán)功能基因的研究（圖2-B）。分子檢測技術在幫助研究者有效識別氮循環(huán)各過程中的關鍵微生物類群、揭示不同環(huán)境中氮循環(huán)功能微生物與環(huán)境的互作機制方面起到了重要作用，為我們更深入地解析不同生態(tài)系統(tǒng)中氮循環(huán)過程對全球氣候環(huán)境變化的響應與反饋奠定了理論基礎。

2 固氮作用功能基因nifH

固氮作用（Nitrogen fixation）是N2被還原成NH4+和其他含氮化合物的過程（圖1），微生物在此過程中發(fā)揮重要作用。有研究表明生物固氮作用貢獻了生物圈中近一半的氮元素年輸入總量［40］，是自然生態(tài)系統(tǒng)和農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中重要的氮來源過程。固氮酶由nifD和nifK基因編碼的異源四聚體以及nifH基因編碼的二氮酶還原酶亞基兩個組分構成［40］。nifH基因作為固氮作用的標記基因［41］，主要基于兩點考慮：一是，目前已知的所有固氮生物都包含nifH基因；二是，基于nifH基因的系統(tǒng)發(fā)育關系和16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育關系非常地接近［42］。nifH基因的同系物可分成5個主要的系統(tǒng)發(fā)育群系［43］，而根據(jù)同源性收集的nifH基因數(shù)據(jù)庫（http：//www.css.cornell.edu/faculty/buckley/nifh.htm）可用于系統(tǒng)發(fā)育和進化的相關分析、探針/引物的設計和評估、以及固氮酶基因多樣性的檢測［40-42］。

圖2 不同分子檢測技術應用于環(huán)境樣本（A）和氮循環(huán)功能基因（B）的發(fā)展史

基于nifH基因的高通量分子檢測技術能更深入、全面、細致地揭示不同土壤生態(tài)系統(tǒng)中固氮微生物的組成、多樣性及功能。在自然土壤固氮微生物的研究中，Soni等［42］使用基于PCR擴增的克隆文庫方法研究了西印度喜馬拉雅山脈土壤中的固氮微生物，結果表明大多數(shù)固氮微生物屬于γ-變形菌（γ-Proteobacteria），且不同的土壤類型中的固氮菌群落結構不同。Wang等［44］應用454焦磷酸測序法研究騰格里沙漠植被恢復地區(qū)中100年來固氮微生物的演化，發(fā)現(xiàn)在植被恢復區(qū)表層土中進行固氮作用的微生物主要屬于藍藻（Cyanobacteria），藍藻不僅維持著沙漠表土中的固氮收支平衡，對沙漠中的初級生產力也有極大的貢獻。在農業(yè)土壤固氮微生物研究中，Wang等［45］使用qPCR和T-RFLP技術，分析了小麥生長季節(jié)中在四種不同施肥模式下、不同深度土壤中固氮微生物群落豐度和結構的變化；結果表明隨著土壤深度的增加nifH基因和16S rRNA基因豐度下降，而土壤深度增加帶來的土壤理化性質的變化是影響固氮微生物群落結構的主要因子，而非取樣季節(jié)或施肥模式。Zhang等［46］使用ITPGM（Ion Torrent Personal Genome Machine）和454焦磷酸測序對四種不同作物類型和輪作方式的種植系統(tǒng)土壤樣品中微生物的nifH基因進行檢測，發(fā)現(xiàn)在5%氨基酸序列不相似性水平下，總共檢測到6182個操作分類單元（Operational taxonomic units, OTU），現(xiàn)有作物類型和輪作歷史是顯著影響固氮微生物群落結構的重要因素。土壤生態(tài)系統(tǒng)的固氮微生物研究發(fā)現(xiàn)，自然土壤生態(tài)系統(tǒng)中固氮菌主要包括γ-變形菌和藍藻，固氮菌對土壤植被恢復有一定的貢獻，農業(yè)土壤生態(tài)系統(tǒng)中固氮菌受到土壤深度、作物類型和輪作歷史帶來的土壤理化性質的變化的顯著影響。

在水體環(huán)境中，高通量分子檢測技術也有更好的表現(xiàn)。Wang等［47］綜合使用nifH基因克隆文庫、DGGE法、qPCR、逆轉錄PCR法，研究發(fā)現(xiàn)藍藻是中國東圳水庫中主要的固氮微生物；水分層/混合狀態(tài)和氮含量會導致固氮菌群落分布的垂直模式和季節(jié)模式的變化，從而影響水體的氮循環(huán)。Xiao等［48］使用焦磷酸測序法對中國南海從珠江三角洲到開闊海域200m以上的表層海水中的固氮菌群進行研究，發(fā)現(xiàn)固氮菌的多樣性很低，主要由γ-變形菌和束毛藻屬（Trichodesmium）組成，而水深是影響固氮微生物豐度和多樣性的最重要的因素。綜合土壤環(huán)境和水體環(huán)境中固氮菌的研究發(fā)現(xiàn)，γ-變形菌和藍藻確實是占主導的固氮微生物。在水體環(huán)境中，水深是影響固氮菌垂直分布的主要原因。

454焦磷酸測序、qPCR、克隆文庫等方法能較為全面地檢測nifH基因在土壤環(huán)境和水體環(huán)境中的分布。其中，454焦磷酸測序法和qPCR的到的數(shù)據(jù)更為細致。但每一種技術都有其局限性（表1），新的技術在解決之前技術局限性的同時，也會產生新的問題。在有完善的數(shù)據(jù)庫的前提下，使用更新的高通量分子檢測技術能更深入、全面、細致地揭示不同生態(tài)系統(tǒng)中固氮微生物的組成、多樣性及功能。

3 硝化作用功能基因

硝化作用（Nitrification）廣泛存在于各種生態(tài)系統(tǒng)中，對生態(tài)系統(tǒng)生產力和營養(yǎng)物質循環(huán)以及廢物處理都起著極為重要的作用［6］。該過程包含3個小步驟，NH4+氧化為NH2OH，進而被氧化為，最后NO2-被氧化為NO3-（圖1），對應的功能基因分別是 a moA、hao［49］和 n xrA 基因［50］。原來認為氨氧化過程和亞硝酸鹽氧化過程是由不同的微生物完成，而最新發(fā)現(xiàn)的完全硝化菌可以獨自完成這兩個過程［8-9］。

3.1 氨單加氧酶基因amoA

氨單加氧酶（Amo）催化NH4+氧化為NH2OH，是氨氧化作用中重要的酶［51］，Amo操縱子由amoA、amoB和amoC這3個結構基因構成，amoA基因編碼Amo的活性蛋白亞基，且具有一定的序列保守性［49］。已經證實amoA基因和16S rRNA在系統(tǒng)發(fā)育上是一致的，且存在于所有氨氧化微生物中［52］，因此被選作Amo酶的功能標記基因，常用于氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細菌（AOB）的檢測分析。通過amoA基因的分子檢測，發(fā)現(xiàn)AOA和AOB廣泛分布于土壤、污水處理系統(tǒng)和海洋環(huán)境中。

在農業(yè)土壤系統(tǒng)中，Cubillos等［53］使用基于16S rRNA和amoA基因的DGGE法研究了哥倫比亞不同畜牧系統(tǒng)對AOB群落的影響，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)單一牧場（Conventional monoculture pastures）中的AOB的豐度以及硝化潛力顯著高于其他兩個系統(tǒng)，多冠層密集型森林畜牧系統(tǒng)（Multi-canopy intensive silvopastoral systems，ISS）中的豐度相對較低，與當?shù)厣值貐^(qū)豐度相當；ISS中的草本、灌木、喬木已被開發(fā)為當?shù)厣蟮娘暳蟻碓矗蓽p少外部投入的需求，以達到保護景觀和改善土壤質量的目的，對ISS進行3-15年的年序研究發(fā)現(xiàn)，年序越大的ISS的細菌群落越趨于相似。Yang等［54］使用基于amoA基因的Illumina Miseq高通量測序檢測中國北部小麥-玉米輪作土壤中施肥種類和灌溉頻率對AOA和AOB的影響，結果表明AOA群落主要受到灌溉頻率的影響，而AOB對于施肥種類有更強地響應；另外，土壤濕度、pH對AOA有顯著影響，總有機碳對AOB影響顯著，而土壤總氮含量對AOA和AOB均有顯著影響。受農業(yè)影響越大的土壤（特別是施肥的影響）中AOB的豐度和硝化潛力越大，越接近于自然生態(tài)系統(tǒng)的農業(yè)土壤中的AOB越接近于普通水平。AOA和AOB對農業(yè)措施的響應是不一樣的，AOA群落受到灌溉頻率的影響更大。

在廢水處理系統(tǒng)中，Gao等［55］運用基于amoA基因的qPCR檢測生活污水、工業(yè)污水和實驗室污水處理共10個污水處理系統(tǒng)中AOA和AOB的豐度，發(fā)現(xiàn)AOB比AOA豐度更高、分布更廣泛，說明在污水處理系統(tǒng)中AOB可能比AOA發(fā)揮更重要的作用。Zhang等［56］運用基于amoA基因和16S rRNA基因的GeoChip、454焦磷酸測序和qPCR分子檢測技術，分析了螺旋霉素或者氧四環(huán)素廢水處理系統(tǒng)中AOA和AOB的群落變化，結果表明在含有螺旋霉素的廢水處理系統(tǒng)中AOA豐度顯著高于AOB，而氧四環(huán)素系統(tǒng)中AOA豐度低于AOB，無抗生素的對照系統(tǒng)中沒有檢測到AOA；螺旋霉素系統(tǒng)中AOA的78.5%-99.6%屬于奇古菌門（Thaumarchaeota）；GeoChip結果顯示AOA的amoA基因信號強度與螺旋霉素的濃度相關（P＜0.05），AOA在高濃度的螺旋霉素壓力下比AOB更能占據(jù)優(yōu)勢。在不同的廢水處理系統(tǒng)中，AOA和AOB的分布和豐度是不一樣的，在生活污水、工業(yè)污水、實驗室污水和氧四環(huán)素污水中AOB比AOA豐度更高，而在高濃度的螺旋霉素壓力下AOA比AOB更能占據(jù)優(yōu)勢。

在海洋環(huán)境中，影響氨氧化微生物群落組成和分布的主要環(huán)境因素有溫度、鹽度、深度、水溶氧含量和碳氮含量等。Vetterli等［57］運用基于amoA基因的T-RFLP法分析發(fā)現(xiàn)，芬蘭海灣富營養(yǎng)化沉積物中氨氧化微生物的豐度很高，其中AOA群落分布格局具有強烈的空間變化，而AOB群落分布則具有顯著的時間變化特點，而在開放海域，AOA和 AOB豐度很低，以芬蘭海灣特有的物種為主；影響氨氧化微生物時空分布模式的主要環(huán)境因素有鹽度、碳氮含量以及水溶氧含量。Bertagnolli等［58］運用基于amoA基因的Illumina Miseq高通量測序檢測智利海岸海水中奇古菌的豐度，智利海岸海水是季節(jié)性低氧或缺氧的，其溫度、鹽度和深度是對奇古菌群落組成影響最大的因素；奇古菌門的Nitrosopumilus-A在所有樣本中均有分布（42%-100% OTU），而Nitrosopumilus-B主要分布在春夏季節(jié)含氧量下降的深層海水中。在海洋環(huán)境中AOA和AOB的分布格局不同，AOA受空間分布影響，而AOB受時間分布影響，溫度、鹽度、深度等環(huán)境因素都是影響海洋氨氧化微生物的重要因子，而影響不同遺傳譜系的AOA的環(huán)境因子也不同。

不管在土壤、廢水還是海洋系統(tǒng)中，AOA和AOB的表現(xiàn)都會呈現(xiàn)出明顯的差異，對兩者產生影響的環(huán)境因子也不同。目前很多研究中都會使用不同的技術手段對這兩者進行分別研究，但無疑更新的、更細致的技術能夠更好地檢測出這兩者之間存在的更細微的差別，目前檢測兩者表現(xiàn)差異使用比較多的技術是Illumina Miseq高通量測序、GeoChip和 qPCR［54，56，58］。

3.2 羥胺氧化還原酶基因hao和亞硝酸鹽氧化還原酶基因nxrA

羥胺氧化還原酶（Hao）催化NH2OH氧化為，hao基因是對應的功能標記基因［49］。對hao基因的研究目前主要集中于分離純菌株及對功能蛋白和基因結構的研究［49，59-61］，對其在環(huán)境樣本中的研究則鮮有報道。陳春蘭等［49］以一個水稻長期定位試驗田為平臺，構建hao基因和amoA基因克隆文庫，研究長期施氮肥對亞硝化菌和氨氧化菌多樣性及其群落結構的影響。結果表明，施氮肥使氨氧化微生物和亞硝化菌多樣性降低，群落結構趨于單一。

亞硝酸鹽氧化還原酶（Nxr）催化NO2-氧化為。Nxr酶是由一個α亞基和一個β亞基組成的異源二聚體，nxrA基因編碼Nxr酶催化亞基α亞基，是 Nxr酶的功能標記基因［50］。Rani等［62］將 nxrA基因作為功能標記基因進行擴增子焦磷酸測序，發(fā)現(xiàn)全球六個不同地域的海洋沉積物中的硝化刺菌屬（Nitrospina）細菌數(shù)量分布出乎意料的少，且極地區(qū)域的多樣性低于非極地區(qū)域。

在以上報道中，檢測到的硝化作用相關功能基因主要分布在在農業(yè)系統(tǒng)土壤、廢水系統(tǒng)和海洋環(huán)境中。amoA基因是硝化作用中最受關注的基因，研究amoA基因使用的檢測技術非常多樣，從Illumina Miseq高通量測序、GeoChip功能基因芯片、qPCR到DGGE、T-RFLP、克隆文庫均有涉及。GeoChip功能基因芯片、qPCR均可定量，但qPCR通量偏低；Illumina Miseq高通量測序、GeoChip功能基因芯片通量高，但GeoChip功能基因芯片只能檢測已知基因序列，Illumina Miseq高通量測序有讀長限制以及取樣、測序時隨機因素和PCR擴增的影響［11］。

4 反硝化作用功能基因

反硝化作用（Denitrification）從NO3-到N2包 括四個 過 程（圖1）：NO3-→NO2-、NO2-→NO、NO→N2O和N2O→N2，這些反應過程對應的功能標記基因分別是narG基因、nirK和nirS基因、norB基因以及nosZ基因。一直以來人們都認為反硝化作用只由細菌完成，然而近年來有研究表明真菌和古菌也能進行反硝化活動［63］。

4.1 硝酸鹽還原酶基因narG

催化NO3-還原化為的硝酸鹽還原酶（Nar）由兩個在胞質中的亞基NarGH、一個膜結合亞基NarI以及NarDJ組成，narG基因編碼Nar酶的活性亞基NarG亞基，是Nar酶的功能標記基因［64-65］。

目前，以narG基因作為標記基因檢測環(huán)境樣本中的反硝化菌的研究相對而言并不特別多。Philippot等［66］構建narG基因克隆文庫，對玉米的不同培養(yǎng)變種根際反硝化菌群落進行分析，發(fā)現(xiàn)環(huán)境因素比玉米變種類型對反硝化菌的群落的影響更大。Deiglmayr等［67］運用基于narG基因的PCR-RFLP法分析發(fā)現(xiàn)，NO3-濃度變化對硝酸鹽還原菌群落功能穩(wěn)定性的影響不顯著，是因為Nar酶對草地土壤中濃度變化有很高的適應性。Bulc等［68］使用qPCR法研究了人工溝渠中narG基因的分布，發(fā)現(xiàn)無論溝渠中廢水的含氧量和含氮量如何，高度波動的排水模式是影響整個廢水系統(tǒng)中narG基因豐度和分布的主要原因。以上結果表明，在農業(yè)土壤和廢水溝渠中NO3-濃度和含氮量都不是影響narG基因豐度和分布的主要原因。

4.2 亞硝酸還原酶基因nirK和nirS

亞硝酸鹽還原酶（Nir）催化NO2-還原化為NO。Nir酶復合體中，nirK基因編碼依賴銅離子的亞基NirK，而nirS基因編碼含有細胞色素cd-1的亞基 NirS［65，69，70］。在水體環(huán)境中 nirS 基因的豐度和多樣性顯著高于nirK，但通過這兩個基因得到的群落結構均存在季節(jié)性變化。Lee等［71］使用基于nirS和nirK基因的qPCR法研究反硝化菌在舊金山海灣河口沉積物中的分布，發(fā)現(xiàn)在河口區(qū)域nirS基因的豐度和多樣性均顯著高于nirK；兩個基因存在相似的空間變化規(guī)律，而時間變化規(guī)律有差異；當硝酸鹽濃度高時nirS豐度高，而溫度低時nirK豐度高。Zhou等［72］使用基于nirS和nirK基因的Illumina Miseq高通量測序研究中國北部一個淺層富營養(yǎng)化的水庫中反硝化菌群落結構的變化，NirS型反硝化菌的豐度和多樣性高于NirK型反硝化菌；沉積物總氮和溫度是影響反硝化菌群落結構季節(jié)性變化的重要環(huán)境因子。

4.3 一氧化氮還原酶基因norB

一氧化氮還原酶（Nor）將NO還原為N2O，norB基因編碼Nor酶復合體NorBCDEFQZ中的NorB亞基，是 Nor酶的功能標記基因［65］。Fagerstone等［73］通過norB基因的PCR檢測確認反硝化菌的存在，且發(fā)現(xiàn)抗生素處理反硝化細菌可以大大減少微藻養(yǎng)殖中N2O的排放量。Kearns等［74］構建norB基因和nosZ基因的克隆文庫，同時使用qPCR法分析發(fā)現(xiàn)施氮肥的鹽沼中含有norB基因和含有nosZ基因的微生物均屬于α-和β-變形菌；當?shù)蕽舛确浅８邥r，nosZ基因豐度顯著降低，norB基因豐度沒有顯著變化?？股乜梢越档蚽orB基因豐度，但高氮肥濃度對norB基因沒有顯著影響。

4.4 氧化亞氮還原酶基因nosZ

氧化亞氮還原酶（Nos）將N2O還原為N2。Nos酶在系統(tǒng)發(fā)育上有兩個不同的NosZ分枝，一個分枝含有典型的Z型NosZ蛋白，另一個含有非典型的NosZ蛋白［75］。編碼典型的Z型NosZ蛋白的nosZ基因存在于能夠完成反硝化作用的細菌中，是Nos酶的功能標記基因；非典型的nosZ基因存在于能夠完成更多樣化的氮代謝途徑的細菌中，包括那些缺乏 nirS和 nirK基因的細菌［75-77］。Orellana等［75］結合宏基因組鳥槍測序法和基于nosZ基因的Illumina測序，分析了美國中西部玉米主要產區(qū)代表性的砂質和泥質土壤中nosZ基因的豐度和多樣性，發(fā)現(xiàn)非典型的nosZ基因數(shù)量超過典型的nosZ基因，突出了非典型nosZ基因微生物在土壤中和在其他環(huán)境中消耗N2O的潛在作用。

貝利尼（Giovanni Bellini）（約 1430～1516年）的一組小型嵌板系列油畫《四寓意》（Four Allegories）（約 1490～1503 年），其中一幅便以“機運”（Fortune）（圖 1）為主題，畫中女子坐在一艘船上，神色憂郁地扶著一個球體，身旁幾個天童（Puttoes）的動作表情，有的表現(xiàn)出驚慌和擔憂，也有的焦急和絕望。

水體環(huán)境中溶解氧濃度是影響反硝化菌的重要因素。Wyman等［78］利用qPCR方法分析了阿拉伯海富氧和弱氧的海水中進行反硝化作用的α-變形菌的nosZ基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)寬闊富氧的海洋表面比弱氧的海水中的反硝化菌豐度高，富氧的海洋表面可能是N2O的潛在匯。

反硝化作用可以將環(huán)境的硝態(tài)氮肥轉化為N2O和N2釋放到大氣中，與農業(yè)系統(tǒng)息息相關。在以上研究中，對反硝化作用相關功能基因使用最多的分子檢測技術是qPCR。qPCR有很好的定量性，可以定量不同環(huán)境中反硝化作用功能基因的分布，但其通量低、非特異性擴增和擴增偏差也是很明顯的局限性（表1）。

5 厭氧氨氧化作用功能基因

厭氧氨氧化作用（Anammox）將NH4+氧化為N（2圖1）。厭氧氨氧化作用的分子機制雖然一直未知，但Kartal等［79］提出，厭氧氨氧化作用中N2H4是由厭氧底物NH4+和NO2-產生，NO是N2H4的直接前體。hzsA基因和hzo基因均可以提供環(huán)境中厭氧氨氧化細菌的物種分類信息，甚至可能比16S rRNA基因更勝一籌，經常作為厭氧氨氧化細菌的標記基因［80-81］。

N2H4合成酶（Hzs）催化在厭氧條件下與由還原產生的NO反應生成N2H4，Hzs酶由hzsA、hzsB、hzsC基因共同編碼，hzsA基因編碼Hzs酶的α亞基，是Hzs酶的功能標記基因［82-83］。N2H4氧化還原酶（Hzo）催化N2H4氧化為N2，Hzo酶由hzo 基因編碼［84］。

厭氧氨氧化細菌分布非常廣泛，在海洋、海岸和江河口的沉積物、紅樹林、海洋冰塊和淡水湖中，甚至是西非、智利和秘魯?shù)妊鯕夂孔钚В∣xygen minimum zones，OMZs）都發(fā)現(xiàn)有厭氧氨氧化細菌的存在［6］。Russ等［85］運用基于hzsA基因的qPCR分析加利福尼亞灣兼有冷烴富集流和熱液噴口地區(qū)的沉積物，發(fā)現(xiàn)所有的厭氧氨氧化菌都與“Candidatus Scalindua”屬相近，但系統(tǒng)發(fā)育上屬于兩個不同的hzsA基因序列簇，相似性低于76%。Bale等［86］在英格蘭北海南部砂質和泥質砂巖沉積物中，通過16S rRNA和hzsA基因的逆轉錄qPCR和15N穩(wěn)定同位素標記實驗發(fā)現(xiàn)，厭氧氨氧化菌在有機碳含量高的沉積物中活性更高，并且在夏天比冬天活性和豐度更高。Sun等［81］構建16S rRNA基因和hzo基因克隆文庫，發(fā)現(xiàn)NH4+與、的比例顯著影響了厭氧氨氧化細菌在東江河中的垂直分布。Naeher等［84］運用基于16S rRNA基因和hzo基因的qPCR分析發(fā)現(xiàn)，厭氧氨氧化菌在整個法國塞納河河口中均有分布，且豐度很高。以上研究中檢測到的厭氧氨氧化菌主要分布在水體環(huán)境中，hzsA基因標記的厭氧氨氧化菌在有機碳含量高的沉積物中活性更高，而不同氮素形態(tài)的比例會顯著影響hzo基因標記的厭氧氨氧化菌。

厭氧氨氧化作用功能基因一般分布在水體環(huán)境中。使用最多的分子檢測技術是qPCR，可以對分布于不同水體環(huán)境中的厭氧氨氧化作用功能基因進行定量和檢測（表1）。

6 氮同化還原作用及異化還原作用功能基因

6.1 硝酸鹽同化還原酶基因nasA、narB和異化還原酶基因napA

硝酸鹽同化還原酶Nas和Nar催化NO3-同化還原為Nas酶大亞基由 nasA 基因編碼，相應的功能基因是nasA基因［89］，而硝酸鹽同化還原酶Nar的標記基因為narB基因［90］。硝酸鹽異化還原酶（Nap）催化NO3-異化還原為，napA 基因編碼Nap酶復合體NapAB中的NapA亞基。Feng等［91］運用PCR擴增napA基因，發(fā)現(xiàn)三個油井廢水中napA基因的豐度和分布會隨著有機碳濃度的變化而變化，才將napA基因作為異化硝酸鹽還原菌的標記基因。

海洋環(huán)境中，氮同化還原菌的生物地理分布模式與環(huán)境條件密切相關。Paerl等［92］在加州灣一個由沿岸涌升流和貧營養(yǎng)太平洋組成的動態(tài)區(qū)域（California current system，CCS）中，運用qPCR分析發(fā)現(xiàn)在CCS的核心區(qū)域聚球藻的數(shù)量和聚球藻narB基因的豐度較低，而沿岸過渡地帶較高；該研究組運用同樣的方法分析發(fā)現(xiàn)，蒙特利灣每年春季上升的涌流導致聚球藻種群及其narB基因亞群豐度下降，且所檢測的金屬離子等環(huán)境因子對narB 基因的豐度沒有顯著影響［93］。Jiang等［89］建立 16S rRNA和nasA基因克隆文庫，分析硝酸鹽同化細菌在幾個大洋沿岸海域的地理分布和多樣性，發(fā)現(xiàn)鹽濃度、溫度和硝酸鹽濃度是影響氮同化還原菌的分布和多樣性的主要環(huán)境因子。

6.2 亞硝酸鹽同化還原酶基因nirA、nirB和異化還原酶基因nrfA

亞硝酸鹽同化還原酶（Nir）催化NO2-同化還原 為nirA 和 n irB 基 因 分 別 編 碼 N irA 和NirB亞基，這兩種基因可作為Nir酶的功能標記基因［95］。在多種藍藻中已發(fā)現(xiàn)一種nirA操縱子，包含亞硝酸同化還原酶基因nirA、編碼轉運NO-和NO-32的ABC型轉運蛋白的nrtABCD基因，和硝酸鹽同化還原酶基因narB，nirA操縱子只有在NO-或NO-32濃度高而NH4+濃度低的時候才會高度表達［95］。nirB基因轉錄在nirA操縱子的上游，其編碼的NirB酶在NirA酶成熟過程中扮演骨架蛋白的角色，NirA酶的表達需要NirB酶的存在［95-97］。Alcantara-Hernandez等［98］利用narB基因和nirA基因作為功能標記基因對墨西哥一塊極端鹽堿地（以前是Texcoco湖）進行擴增子測序，發(fā)現(xiàn)含有narB和nirA基因的嗜鹽古菌占主要地位；在pH大于10甚至更高的環(huán)境中NH4+會轉化成NH3，而NO3-和NO2-是更好的氮源，所以嗜鹽古菌對硝酸鹽的代謝能力對其生存有重要意義。

甲酸依賴型亞硝酸鹽還原酶（Nrf）催化NO-2異化還原為NH4+。Nrf酶由一個7個基因組成的操縱子nrfABCDEFG編碼，nrfA編碼的催化亞基NrfA是利用NO2-作為電子受體的細胞色素C，nrfBCD編碼的蛋白將電子轉移到催化亞基NrfA上，nrfEFG編碼的血紅裂解酶（Heme lyase）將血紅素（Heme group）連結到NrfA催化位點上［99］。nrfA基因是Nrf酶的標記基因。Song等［100］以nrfA基因為標記基因對美國北卡羅來納州一個淺瀉湖河口沉積物群落進行焦磷酸測序，發(fā)現(xiàn)其中DNRA活性和nrfA基因的豐度隨有機質含量的增加而上升，有機碳的可獲得性是DNRA群落活性的重要調節(jié)因子。

隨著對DNRA的認識逐漸加深，DNRA也還漸成為研究的熱點之一［2］。在氮同化還原和異化還原作用研究中，使用的分子檢測技術有焦磷酸測序、qPCR、克隆文庫等，目前對這兩個過程的功能基因的研究還不是很多，但是隨著關注度的加深也會隨之變多。

7 氨化作用及同化作用

氨化作用（Ammonification），也稱作氮礦化作用（Nitrogen mineralization），是有機質氮轉化為的過程（圖1）［101］。不同的有機質需要不同的酶催化氨化作用，其中尿素酶（Urease）催化尿素的氨化作用。尿素酶可催化尿素分解為NH4+，系統(tǒng)命名為酰胺水解酶［102-103］，細菌、植物和動物體內都含有尿素酶，通過將尿素分解為NH4+的過程獲取能量［104］。細菌尿素酶基因簇由結構基因、輔助基因和調節(jié)基因組成，結構基因包括ureA、ureB和ureC基因，分別編碼α、β和γ亞基；輔助基因包括ureD、ureE、ureF、ureG、ureH、ureI等，ureR是調節(jié)基因。ureC基因編碼尿素酶維持酶活性的蛋白，是尿素酶的標記基因［103］。

同化作用（Assimilation），又稱為合成代謝，是指生物體利用能量將小分子合成為大分子的一系列代謝途徑。所有的氮循環(huán)微生物可通過同化作用利用環(huán)境中的小分子氮化物合成含氮大分子［105］。

8 結論與展望

生態(tài)系統(tǒng)是一個整體，而氮循環(huán)并非獨立存在于生態(tài)系統(tǒng)中，氮元素不同形式轉化過程中，會偶聯(lián)其他元素的轉化過程，如碳循環(huán)、硫循環(huán)等，其中厭氧甲烷氧化和反硝化作用的偶聯(lián)就是非常典型的例子［106］。未來對氮循環(huán)的研究必然會發(fā)展為氮循環(huán)偶聯(lián)其他生物地球化學循環(huán)的研究。但不管研究的方向如何改變，分子檢測技術都是其中重要的研究手段，正如高通量測序發(fā)現(xiàn)完全硝化菌的過程［8-9］。單細胞測序無疑是目前最新的技術，而高通量qPCR是在普通qPCR基礎上研發(fā)的高通量技術［107］，雖然目前還沒有這些新技術應用在氮循環(huán)研究中的實例，但在不久的將來，這些新技術必然會給氮循環(huán)研究帶來新的發(fā)現(xiàn)。

此外，大數(shù)據(jù)時代帶來的另一方面的需求就是數(shù)據(jù)分析平臺的建立。隨著微生物組學技術的普及，在未來數(shù)十年之內數(shù)據(jù)分析的基礎平臺建設將對氮循環(huán)微生物功能基因的研究提供保障，而分析技術本身的研究和發(fā)展也非常重要，基礎性分析和存儲平臺的建設可為氮循環(huán)功能類群研究提供堅實的基礎［108］。以功能基因為起點，以日益發(fā)展的數(shù)據(jù)分析平臺為支撐，分子檢測技術的革新能夠更深入全面地了解參與氮循環(huán)的微生物功能類群多樣性，最終為環(huán)境科學、生態(tài)學和地球科學的發(fā)展帶來新的契機。

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