★ 孫福娟 于凡 姚文琪 李國轉(zhuǎn) 李旭 吳孟 陳衛(wèi)東

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 合肥 230012)

丹參酮ⅡA(tanshinone IIA，TA)是從中藥丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根及根莖中提取分離的二萜醌類化合物，其具有廣泛的生理活性，如抗腫瘤、保護(hù)心腦血管、抗氧化、抗菌、保腎保肝等作用[1-5]，且不良反應(yīng)較少。然而丹參酮IIA難溶于水，口服胃腸吸收差，生物利用度低，嚴(yán)重限制其療效的發(fā)揮[6]。納米脂質(zhì)載體(nano structured lipid carrier，NLC)是在一定溫度下將固態(tài)脂質(zhì)和空間上不相容的液態(tài)脂質(zhì)混合，在固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nano particles,SLN)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的第二代脂質(zhì)納米載體。據(jù)報(bào)道，NLC已被視作是脂質(zhì)體和SLN的優(yōu)良替代物，其具有較強(qiáng)的藥物保護(hù)作用，便于長期儲(chǔ)存，可明顯提高口服生物利用度，并改變藥物在體內(nèi)的分布[7-8]。但是，NLC進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)會(huì)被單核細(xì)胞吞噬系統(tǒng)(MPS)視作異物進(jìn)而被吞噬，大大縮短了納米粒在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間[9]。近年來，眾多研究者選用含聚乙二醇(PEG)的材料對(duì)納米粒表面進(jìn)行修飾，從而躲避MPS的吞噬。同時(shí)，PEG還具有改善納米粒親水性從而達(dá)到長循環(huán)、提高納米粒穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)[10-12]。

因此課題組從藥劑學(xué)方面著手，結(jié)合長循環(huán)納米載體的優(yōu)點(diǎn)，制備丹參酮IIA聚乙二醇化納米脂質(zhì)載體，以期達(dá)到改善口服胃腸吸收，提高生物利用度的目的，為后續(xù)劑型的研究提供參考依據(jù)，擴(kuò)大丹參酮IIA在臨床方面的應(yīng)用。

1 材料

1.1 儀器 LC-16C高效液相儀(日本島津)；AB135-S型十萬分之一天平(德國梅特勒-托利多公司)；DF-101B數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；XW-80A微型渦旋混合器(上海滬西分析儀器廠有限公司)；KQ-300B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；LC-4016型低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；超濾離心管(美國Milipore)；Zetasizer Nano ZS 90粒度測定儀(英國馬爾文公司)；透射電子顯微鏡(TEM，JEM-100SX，日本JEOL公司)。

1.2 試劑 丹參酮IIA原料藥(純度≥98%，西安鴻生生物技術(shù)有限公司，批號(hào) 140320)；丹參酮IIA標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào) 110766-200619)；單硬脂酸甘油酯、聚乙二醇硬脂酸(湖南爾康制藥股份有限公司)；中鏈脂肪酸(廣州市宏晟化工原料有限公司)；蛋黃卵磷脂(安徽豐原醫(yī)藥公司)；聚山梨酯-80(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；葡聚糖凝膠G-50(北京恒輝科技有限公司)；甲醇(色譜純，上海信可有限公司)；無水乙醇(上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司)；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 NLC的制備 通過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)考察，本實(shí)驗(yàn)最終選用乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備TA-P-NLC。操作如下：將處方量的GMS、PEG-SA、MCT、卵磷脂和TA溶于5mL無水乙醇中，水浴加熱升溫至70℃構(gòu)成油相；再將一定量的T-80溶于15mL超純水中，水浴加熱至與油相同溫，構(gòu)成水相。用1mL注射器將水相緩慢勻速地注入到正在攪拌(1000r/min)的油相中，攪拌時(shí)間為2.5h。待有機(jī)溶劑完全揮發(fā)后，將乳液迅速轉(zhuǎn)移至盛有20mL冰水的錐形瓶中，繼續(xù)攪拌1.5h，即得TA-P-NLC。

2.2 TA分析方法的建立 經(jīng)紫外掃描，確定檢測波長為270nm。經(jīng)優(yōu)化確定色譜條件為：流動(dòng)相為甲醇-水(85∶15)，進(jìn)樣量20μL，流速1.0 mL/min，柱溫30℃。該條件下，進(jìn)行方法學(xué)考察。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，溶劑、輔料等對(duì)TA的測定無干擾，專屬性較好；丹參酮IIA在0.1～32.0μg/mL與峰面積呈良好線性關(guān)系，回歸方程為Y=136492X+50189(r=0.9992)；低、中、高(0.10、1.0、10.0 μg/mL)3個(gè)質(zhì)量濃度的日內(nèi)精密度RSD分別為1.45%、0.53%、1.37%，日間精密度RSD分別為0.64%、1.38%、1.26%；1.6、2.0、2.5μg/mL 3種質(zhì)量濃度的平均回收率為(100.02±0.94)%，RSD分別為1.65%、1.25%、1.66%；平行制備供試液6份并逐個(gè)進(jìn)樣，峰面積RSD值為1.28%，重復(fù)性良好；室溫下溶液8h內(nèi)穩(wěn)定性較好(RSD=1.46%)。上述結(jié)果均符合方法學(xué)要求，表明該分析方法適合丹參酮IIA含量的測定。

2.3 包封率的測定 取活化好的葡聚糖凝膠(Sephadex G-50)適量，裝入底部墊有兩層濾紙片的注射器中。待水分自然流下，將其置于低速離心機(jī)中，梯度離心使凝膠柱失水皺縮，得到Sephadex G-50微型柱。取TA-P-NLC 500μL，上樣于微柱頂部，3000r/min離心3 min，再于柱頂加相同體積的超純水，連續(xù)洗脫4次并收集濾液，加甲醇破乳并定容到3 mL，進(jìn)樣分析并計(jì)算NLC內(nèi)已包裹的TA的質(zhì)量(M1)。另取未過柱的TA-P-NLC 500μL，先加0.8mL的超純水，再加適量甲醇并定容到3mL，同法分析并計(jì)算體系中總的TA質(zhì)量(M0)。

(包封率=M1/ M0×100%)。

2.4 正交試驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)篩選出3個(gè)主要影響因素：GMS與PEG-SA的質(zhì)量比(A)、MCT占總脂質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)、卵磷脂質(zhì)量濃度(C)。每個(gè)因素各取三個(gè)水平，根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的原理，以包封率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按照L9(34)正交表設(shè)計(jì)安排試驗(yàn)，因素水平表見表1，正交設(shè)計(jì)結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 正交設(shè)計(jì)包封率的結(jié)果(Mean±SD, n=3)

表3 方差分析

由表2可知，各因素對(duì)包封率的影響大小依次為A1>A2>A3，B2>B1>B3，C3>C1>C2；比較極差值可以發(fā)現(xiàn)，各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響大小順序?yàn)锳>B>C。同時(shí)分析表3可知，因素A對(duì)包封率影響顯著。因此，最優(yōu)處方組合為A1B2C3，即PEG-SA占總脂質(zhì)質(zhì)量的4%，MCT占總脂質(zhì)質(zhì)量的60%，卵磷脂用量為22g/L，T-80含量為2g/L。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照最優(yōu)處方及工藝，平行制備3批TA-P-NLC，并按“2.2”下方法測定，包封率分別為83.49%、84.28%、85.37%。結(jié)果表明該工藝重復(fù)性較好。

2.6 TA-P-NLC理化性質(zhì)研究

2.6.1 形態(tài)學(xué)考察 將所制得的TA-P-NLC溶液，滴加適量于銅網(wǎng)上，自然晾干后置于透射電鏡下觀察納米粒顯微形態(tài)。從圖1可見，TA-P-NLC納米粒呈較規(guī)則的球形，粒子之間無粘連。

2.6.2 粒徑及Zeta電位的測定 在室溫條件下，取TA-P-NLC溶液適量，用超純水稀釋10倍后，將其置于樣品池中。使用納米激光粒度儀測定粒徑和Zeta電位，粒徑分布及Zeta電位分別見圖2～3。由圖可知，TA-P-NLC平均粒徑為218.8nm，且多分散系數(shù)小于0.3，說明納米粒粒度分布均勻；膠體分散系統(tǒng)中常用Zeta電位評(píng)價(jià)其物理穩(wěn)定性，一般來說，高表面電荷證明粒子之間具有較強(qiáng)的斥力，在水溶液中會(huì)更加穩(wěn)定[13]。本實(shí)驗(yàn)制備的TA-P-NLC Zeta電位為-34.3mV，穩(wěn)定性較好，利于儲(chǔ)存。

圖1 TA-P-NLC的透射電鏡圖

圖2 TA-P-NLC粒徑分布

圖3 TA-P-NLC Zeta電位

2.6.3 DSC分析 以空白鋁鍋?zhàn)鳛閷?duì)照，在氮?dú)鈿夥障?，?0℃/min的速率在一定溫度范圍內(nèi)掃描，分別對(duì)TA、GMS、PEG-SA、TA-P-NLC進(jìn)行DSC分析，使用Origin9.0軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果見圖4。熱解曲線顯示，TA的特征吸熱峰在207℃左右；GMS、PEG-SA的吸熱峰分別為56.5、47.4 ℃；TA-P-NLC曲線圖中，TA的吸熱峰已消失，且無GMS、PEG-SA的吸熱峰，而在110.4℃左右出現(xiàn)一新的吸熱峰。由此說明，TA被NLC成功包載，納米粒已經(jīng)形成，構(gòu)成一新的物相。

圖4 熱解曲線

2.6.4 體外釋放度考察 精密量取TA-P-NLC和TA溶液各5mL置于預(yù)先處理好的透析袋中，將兩端夾緊，放置在盛有50mL含1%吐溫80的PBS(pH7.4)的溶出器皿中，溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為100r/min，平行操作3份。分別在0,1,2,3,4,5,6,7,8,12,20,30,48h取樣0.5mL，同時(shí)快速補(bǔ)加同溫同體積的新鮮釋放介質(zhì)，過0.45μm微孔濾膜后進(jìn)樣分析，并計(jì)算累積釋放量Q。Q=[Ci×V1+(C1+C2+…Ci-1)×V2]/M×100%。

式中C1、C2、Ci-1、Ci分別為第1、2、i-1、i等時(shí)間點(diǎn)釋放介質(zhì)中TA濃度；V1為釋放介質(zhì)的總體積，V2為取樣體積。

結(jié)果見圖5，TA溶液在24h時(shí)基本釋放完全，TA-P-NLC在48h內(nèi)累積釋放量僅為45.63%，說明TA-P-NLC中TA的釋放具有明顯的緩釋特性。

圖5 體外釋放曲線

3 討論

包封率是制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)中最重要的指標(biāo)之一，藥物和輔料的不同導(dǎo)致包封率的測定方法也千差萬別。本研究曾考慮采用超濾離心法，但進(jìn)樣分析發(fā)現(xiàn)濾液中并不能檢測到TA?？赡苁窃陔x心力的作用下，納米粒吸附在濾膜中，游離的TA并不能透過，故檢測不到。使用葡聚糖凝膠微柱離心法分離游離TA，進(jìn)樣分析結(jié)果表明該法能準(zhǔn)確地測定包封率，且操作方便、重現(xiàn)性好、誤差較小，故選擇微柱離心法來測包封率。

在TA-P-NLC制備過程中，轉(zhuǎn)速對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，轉(zhuǎn)速較小導(dǎo)致粒徑過大且分布不均勻，轉(zhuǎn)速較大會(huì)產(chǎn)生大量泡沫，導(dǎo)致藥物與輔料之間混合不充分，放置幾天即有絮凝出現(xiàn)；乳化過程決定了整個(gè)制劑的成功與否，在水相注入油相時(shí)，要控制好注射速度，過快不利于二者的分散融合，過慢由于溫度較高則會(huì)使油相因蒸發(fā)而損失。

本實(shí)驗(yàn)選擇磷酸緩沖液(pH7.4)作為釋放介質(zhì)來模擬體內(nèi)環(huán)境。由于TA難溶于水，故在釋放介質(zhì)中加入1%的吐溫80以達(dá)到漏槽條件。分析體外釋放曲線可知，TA-P-NLC釋放過程可大致分為突釋和緩釋兩部分。前12h左右為突釋過程，累積釋放量約30%，可能是納米粒表面吸附的部分TA快速釋放所致；隨后的釋放過程明顯變慢，一方面可能是納米粒骨架中的藥物隨脂質(zhì)材料的溶蝕使釋放趨于緩慢，另一方面可能是PEG包裹在納米粒表面，從NLC內(nèi)部釋放出的藥物受到其阻礙而變得緩慢。由于體外釋放數(shù)據(jù)不能代表TA在人體中的釋放過程，所以TA-P-NLC的釋放行為應(yīng)通過后續(xù)藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)研究進(jìn)一步證實(shí)。

納米藥物遞送系統(tǒng)具有廣闊的發(fā)展前景，尤其在靶向給藥方面極具優(yōu)勢(shì)與潛力。本實(shí)驗(yàn)成功制備TA-P-NLC，并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，以乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備的TA-P-NLC的粒徑較小且分布均勻、包封率高、體外釋放緩慢，其為丹參酮IIA的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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