仝彩玲，齊忠權(quán)，2（.廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，福建 廈門(mén) 3602；2.廣西大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣西壯族自治區(qū) 南寧 530004）

我國(guó)每年有數(shù)以萬(wàn)計(jì)的患者掙扎在生死線上等待器官移植，而每年器官移植手術(shù)僅約1萬(wàn)例［1］，很多終末期器官衰竭的患者在等待中離世。器官的體外培養(yǎng)和組織工程器官成為解決器官短缺的重要手段［2］。

1 組織工程器官

組織工程器官是以細(xì)胞學(xué)和材料學(xué)為基礎(chǔ)，將細(xì)胞接種在合適的材料上培養(yǎng)以代替受損的組織或器官的一門(mén)學(xué)科［3］。組織工程器官構(gòu)建需要具備三個(gè)必不可少的要素：① 具有生物兼容性良好的支架材料；② 具有合適接種的種子細(xì)胞；③ 種子細(xì)胞在支架上增殖、分化及誘導(dǎo)，最終分化為具有功能的細(xì)胞。隨著干細(xì)胞研究的深入及生物納米材料研究的突飛猛進(jìn)，組織工程器官的研究也進(jìn)入了一個(gè)新階段，越來(lái)越多的組織器官走進(jìn)了大眾的視野，如 ：組織工程皮膚［4］、組織工程血管［5］、組織工程聲帶［6］、組織工程心臟［7］、組織工程腎臟［8］、組織工程肝臟［9］、組織工程視網(wǎng)膜［10］和組織工程膀胱［11］等。組織工程器官可以在一定時(shí)期內(nèi)代替受損器官工作，延長(zhǎng)動(dòng)物和人的生存期。耶魯大學(xué)的科學(xué)家們已經(jīng)使用動(dòng)物細(xì)胞制備出鼠的肺部組織，可以被植入嚙齒動(dòng)物體內(nèi)，并在一定時(shí)間內(nèi)發(fā)揮功效［12］。為了方便得到不同的器官，研究者把材料做成不同的器官形狀，通過(guò)改良材料表面使細(xì)胞在材料上黏附生長(zhǎng)，從而制造出不同的器官［13］。用于組織工程的材料需具備以下特征：① 具有良好的生物相容性。生物材料最終應(yīng)用于人體內(nèi)，具有免疫反應(yīng)的組織工程材料會(huì)受到受體的免疫排斥，造成移植失敗，給受體帶來(lái)巨大痛苦；② 具有合適的表面結(jié)構(gòu)；③ 具有一定的力學(xué)強(qiáng)度和柔韌性。以去細(xì)胞支架為代表的組織工程心臟的研究進(jìn)展如下：2008年研究人員用大鼠原代心肌細(xì)胞接種心臟脫細(xì)胞支架得到可以收縮的心臟，但是該心臟收縮頻率和正常心臟有所不同［7］。2013年Nature Communications上發(fā)表一篇文章，將人的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）誘導(dǎo)為心肌細(xì)胞作為種子細(xì)胞，鼠的脫細(xì)胞支架作為材料，構(gòu)建組織工程心臟，得到具有收縮功能的心臟［14］。這些以動(dòng)物模型為基礎(chǔ)的研究都為人類(lèi)組織工程的構(gòu)建和應(yīng)用打下基礎(chǔ)。Guyette等［15］用人的iPSC作為種子細(xì)胞接種到器官捐贈(zèng)者的心臟去細(xì)胞支架構(gòu)建組織工程心臟，Weymann等［16］用豬的去細(xì)胞支架接種人的細(xì)胞制備組織工程心臟，這些研究都試圖構(gòu)建可以應(yīng)用到人類(lèi)的組織工程心臟，但這些組織工程心臟由于缺乏傳導(dǎo)系統(tǒng)，其和正常心臟的功能還存在很大差異，不能代替正常心臟的功能用于移植。去細(xì)胞支架在組織工程肝臟及組織工程腎臟研究方面都有一定的進(jìn)展，并占據(jù)重要的位置［17］。除脫細(xì)胞支架外，一些無(wú)毒親水性好、生物相容性好及細(xì)胞親和性好的高分子材料，如：海藻酸鹽［18］、膠原蛋白［19］、明膠［20］、水凝膠［21］、瓊脂［22］及一些經(jīng)人工修飾合成的化合材料，如：納米材料［23］、合金材［24］和有機(jī)合成材料［25］都是組織工程常用的材料。

2 3D打印器官

3D打印最早由Charles在1986年提出，通過(guò)電腦建模程序來(lái)設(shè)計(jì)需要打印的器官剖面圖，從而精準(zhǔn)指導(dǎo)隨后的打印過(guò)程，該技術(shù)是一種快速成型技術(shù)，以數(shù)字模型為基礎(chǔ)，運(yùn)用粉末或液體可粘合材料，通過(guò)逐層固化成型的方式來(lái)構(gòu)建具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的物體［26］，常被應(yīng)用于模型制備、工業(yè)設(shè)計(jì)、零部件制造和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域［26］。3D打印應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)中各種組織的再生，包括皮膚、骨骼、血管［27］、氣管、心臟組織和軟骨組織，另外，3D打印還應(yīng)用于組織模型、藥物傳遞及藥物毒性的研究。加利福尼亞大學(xué)研究者利用干細(xì)胞和3D打印技術(shù)相結(jié)合打印出人體肝臟［28］；美國(guó)北卡羅來(lái)納州的研究者使用復(fù)合細(xì)胞的水凝膠材料，逐層打印，構(gòu)建出類(lèi)似腎臟的結(jié)構(gòu)。同時(shí)，他們打印出骨骼、耳鼻、膀胱等人體器官，以達(dá)到為患者提供量身定做器官替代品的目的［29］。然而，3D生物打印目前還存在許多不足之處，例如：材料的選擇，目前還沒(méi)有一種材料可以滿足器官打印的需求，使得細(xì)胞黏附生長(zhǎng)良好，打印的器官功能良好，移植到體內(nèi)后無(wú)免疫反應(yīng)；另外，打印精度也是有待解決的重要問(wèn)題。由于3D打印為逐層打印，精度越高，層數(shù)越多，會(huì)造成器官分層嚴(yán)重，整體性和完整性較差。從理論上講，3D生物打印機(jī)可以使用CT等掃描技術(shù)，得到患者身體的各個(gè)部位精確圖像數(shù)據(jù)，并在隨后的短時(shí)間內(nèi)3D打印出相應(yīng)的組織，由于這些結(jié)構(gòu)來(lái)源于患者的身體掃描，因此，打印后的植入物可以完全模擬原有器官，順利地進(jìn)行替換，從而減輕了植入過(guò)程對(duì)患者身體帶來(lái)的負(fù)擔(dān)。但是，由于器官自組裝的機(jī)制，3D生物打印技術(shù)還有很長(zhǎng)的路要走。相信隨著CT掃描技術(shù)精準(zhǔn)度的提高，3D打印技術(shù)如果可以聯(lián)合細(xì)胞流式分選技術(shù)，使得分選的細(xì)胞利用打印機(jī)精確的定位到器官的不同位置，有望得到具有功能的可供移植的器官。

3 器官體外培養(yǎng)研究

器官體外培養(yǎng)技術(shù)有著悠久的研究歷史，早在1964年Organ culture一書(shū)在巴黎以法語(yǔ)的形式出版，1970年Thomas重新修訂后以英文的形式重新出版，該書(shū)不斷的被修訂。該書(shū)介紹了體內(nèi)各個(gè)器官的培養(yǎng)條件和方法及如何選擇合適的培養(yǎng)基,并回答了早期胚胎干細(xì)胞在體外是否會(huì)按照原來(lái)的發(fā)育，發(fā)育成為器官的問(wèn)題，指出胚胎早期干細(xì)胞會(huì)按照其自身的發(fā)育軌跡，在體外發(fā)育成該細(xì)胞應(yīng)該發(fā)育成的器官，并且指出，與體內(nèi)發(fā)育相比，器官的體外培養(yǎng)產(chǎn)物不變，但體外器官培養(yǎng)生長(zhǎng)速度較體內(nèi)慢。另外，該書(shū)還介紹了一些器官培養(yǎng)的主要方法：① 凝固的血漿基質(zhì)培養(yǎng)法。最初是由Fell和Robison創(chuàng)立，將器官碎片或器官放置在覆蓋有凝固的血漿和雞胚浸出液的表面皿上培養(yǎng)［30］；② 瓊脂基質(zhì)培養(yǎng)法。1952年研究人員在含有胚胎抽出液的瓊脂培養(yǎng)基上直接放置器官的方法進(jìn)行器官培養(yǎng)［30］；③ 漂浮法；④ 格柵培養(yǎng)法；⑤ 交替暴露于培養(yǎng)液和氣相培養(yǎng)法。19世紀(jì)60年代，人們探索了人小腸體外培養(yǎng)的方法，并獲得了關(guān)于器官培養(yǎng)條件的一些經(jīng)驗(yàn)［31］。總結(jié)器官培養(yǎng)的主要關(guān)鍵點(diǎn)包括：① 器官的3D培養(yǎng)環(huán)境。細(xì)胞在體內(nèi)的3D生長(zhǎng)環(huán)境與細(xì)胞在體外的2D培養(yǎng)相比，細(xì)胞在遷移、黏附、增殖和基因表達(dá)方面存在著很大的差異［32］，3D培養(yǎng)能更精確地模擬正常細(xì)胞的形態(tài)、增殖和分化，器官體外培養(yǎng)通常用3D培養(yǎng)方法，人造骨骼即是采用生骨細(xì)胞接種3D支架進(jìn)行骨骼的培養(yǎng)［33］。聚乙二醇的水凝膠是常用的3D培養(yǎng)基質(zhì)，它是一種以水為分散介質(zhì)的凝膠，具有交聯(lián)結(jié)構(gòu)的水溶性高分子中引入一部分疏水基團(tuán)而形成能遇水膨脹的交聯(lián)聚合物，能保持一定的形狀，能吸收大量的水［34］，類(lèi)似果凍，具有高彈性，它與活體細(xì)胞外基質(zhì)相似，可使體外細(xì)胞培養(yǎng)更接近體內(nèi)的生理特征，是基礎(chǔ)研究、藥物篩選和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域細(xì)胞功能研究的常用工具。水凝膠支架還可以交聯(lián)生物活性因子調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化。水凝膠支架在液態(tài)時(shí)包裹細(xì)胞，在固態(tài)時(shí)形成交聯(lián)網(wǎng)狀，細(xì)胞黏附性強(qiáng)，水分充足，從而保障三維狀態(tài)下細(xì)胞的水分交換、營(yíng)養(yǎng)交換和廢物排出能力。近年來(lái)，含磁性氧化鐵的水凝膠被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞的3D培養(yǎng)，細(xì)胞可以懸浮在培養(yǎng)基和磁性物質(zhì)當(dāng)中，擺脫細(xì)胞因重力的作用而發(fā)生聚集［35］；② 氣體組分也是影響器官培養(yǎng)的重要因素，細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中，一般需要5%的CO2濃度和95%的空氣，而器官對(duì)O2的需求量則大大增加，在心臟［7］和小腸［31］培養(yǎng)過(guò)程中O2的濃度達(dá)到90%以上。

4 動(dòng)物嵌合體研究

免疫排斥是器官移植需要解決的一個(gè)重要問(wèn)題，于是從動(dòng)物嵌合體獲取器官成為研究熱點(diǎn)［36-37］。嵌合體在免疫學(xué)上是指一個(gè)機(jī)體有兩種或兩種染色體組成，不同細(xì)胞系同時(shí)存在，彼此耐受，不產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。早期動(dòng)物嵌合體采用胚胎時(shí)期將一種動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞注入另外一種細(xì)胞的胚胎期，使其發(fā)育成嵌合體，這種方法得到嵌合體極低，且不同器官的基因表達(dá)紊亂。隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，研究人員可以通過(guò)基因敲除技術(shù)敲除動(dòng)物某一基因，使其某一器官發(fā)育停止，留出“空位”，再注射另一動(dòng)物的干細(xì)胞，使其發(fā)育成該器官。這種方法得到的器官有望成為獲取器官的重要手段。另外，令人鼓舞的是研究人員通過(guò)孤雌單倍體基因印記改造，制備出單倍體干細(xì)胞［38］，該細(xì)胞具備胚胎干細(xì)胞的功能和配子發(fā)育能力［39］，這也為器官的獲取提供了新希望。

5 展 望

盡管現(xiàn)在還沒(méi)出現(xiàn)一種很好的方法，可以提供大量可供移植的器官，目前器官移植主要來(lái)源于器官捐贈(zèng)。但隨著生物科技的發(fā)展和進(jìn)步，更多和更適合的生物材料的出現(xiàn)，組織工程器官研究將進(jìn)入一個(gè)新階段。從嵌合體動(dòng)物體內(nèi)獲取可供人類(lèi)應(yīng)用的器官在不久的將來(lái)也會(huì)出現(xiàn)在大眾的視野內(nèi)。