王屹，杜婷婷，劉舒佳，劉佳，盧勇泉，楊慧

1.中國康復研究中心北京博愛醫(yī)院，a.檢驗科；b.脊柱脊髓外科，北京市100068；2.首都醫(yī)科大學康復醫(yī)學院，北京市100068；3.首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院，北京市神經外科研究所，北京市100050；4.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院神經生物學系，北京腦重大疾病研究院帕金森病研究所，教育部神經變性病重點實驗室，北京市100069

帕金森病是一種與環(huán)境、基因、年齡等多種因素相關的疾病，主要特征是神經退行性變引起的運動功能障礙[1-2]。帕金森病的主要病理變化是黑質紋狀體通路的破壞及殘存多巴胺神經元中形成路易體，主要成分為α-突觸核小體(α-synuclein,α-syn)。在帕金森病病理進程中，環(huán)境因素和基因因素存在交互作用，環(huán)境因素可能加劇帕金森病相關基因的易感性，造成神經元死亡[3]。

魚藤酮是一種農業(yè)生產常用的殺蟲劑，與帕金森病發(fā)生發(fā)展密切相關，被廣泛用于帕金森病模型的制備。有文獻報道[4-6]，魚藤酮能提高α-syn絲氨酸129位磷酸化水平，從而導致α-syn聚集。盡管魚藤酮制備的帕金森病模型是一種能很好重現帕金森病理的模型，并得到一致認可[7-10]，但魚藤酮引起α-syn病理變化，包括磷酸化水平升高、α-syn聚集的機制尚不明確。

α-syn的磷酸化后修飾與α-syn聚集密切相關。α-syn的磷酸化水平受α-syn激酶的磷酸化和蛋白磷酸酶去磷酸化活性平衡的調節(jié)。α-syn特異性激酶可催化α-syn磷酸化，尤其是129位絲氨酸，并導致路易包涵體中磷酸化的α-syn聚集[11-12]。蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)是目前發(fā)現的唯一α-syn去磷酸化酶。PP2A絲蘇氨酸磷酸酶對保持α-syn絲氨酸129位磷酸化和去磷酸化的平衡極其重要[13]。PP2A催化亞基的磷酸化后修飾，能抑制酶的大部分活力[14]。在細胞內，酪氨酸羥化酶使PP2A的催化亞基307位點酪氨酸磷酸化(phosphorylation of tyrosine 307 at the catalytic subunit of PP2A,pY307-PP2Ac)，這一位點是唯一的酪氨酸磷酸化位點。在黑色素瘤細胞中，脂質閥結合操作性Ca2+進入細胞，從而激活鈣調素，使鈣調素與Src激酶結合，激活Src激酶，從而使PP2A催化亞基307位點酪氨酸發(fā)生磷酸化，造成PP2A失活[15]。

研究魚藤酮能否改變PP2A活性，參與帕金森病的病理過程，將為發(fā)現帕金森病的藥物作用靶點提供依據。本研究通過魚藤酮處理MN9D細胞，研究PP2A活性變化的情況，并研究PP2A活性變化對細胞活力變化的影響。

1 材料與方法

1.1 MN9D細胞系

原代小鼠胚胎腹側中腦細胞與小鼠神經母細胞瘤細胞系N18TG2融合形成的雜交瘤細胞，由Novartis公司Bastian Hengerer博士惠贈，使用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 魚藤酮的制備與細胞分組

稱取一定量魚藤酮，溶于無菌二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)，配制終濃度為5 mmol/L儲存液，-20℃冰箱避光保存，1周內使用。使用時室溫融化，吸取相應的量，在培養(yǎng)基中按照比例稀釋成10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L。本研究中，除細胞活力檢測外，細胞實驗均在直徑90 mm培養(yǎng)皿中進行，加培養(yǎng)基10 ml，加魚藤酮100μl。

實驗分組：正常組正常培養(yǎng)細胞；對照組培養(yǎng)液中加入與魚藤酮組等體積的DMSO；魚藤酮組培養(yǎng)液中加入不同濃度魚藤酮培養(yǎng)24 h；魚藤酮+C2組培養(yǎng)液中先加5μmol/L PP2A特異性激動劑C2-神經酰胺培養(yǎng)0.5 h，再加魚藤酮50 nmol/L培養(yǎng)8 h后，撤去C2-神經酰胺，再培養(yǎng)至24 h。

1.3 細胞活力檢測

MN9D細胞用培養(yǎng)基100 μl按1×104個/孔的密度接種于96孔板。細胞穩(wěn)定貼壁后，在培養(yǎng)體系中加入適當體積魚藤酮，使其終濃度分別為10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L。24 h后，各孔加入5 mg/ml噻唑藍20μl，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 100μl，避光振蕩10 min，使生成的顆粒完全溶解。將孔板置于酶標儀中，讀取550 nm波長處吸光度值，統(tǒng)計制圖，計算細胞活力。

1.4 Western blotting

在RAPI細胞裂解液中，按100∶1加入復合磷酸酶抑制劑和復合蛋白酶抑制劑；收集細胞，裂解離心，取上清液，BCA法蛋白定量。積層膠80 V、分離膠120 V電泳后，PVDF膜100 mA半干轉1 h；將PVDF膜置于10%牛奶封閉液中，室溫封閉1 h，依次孵育兔抗pY307-PP2Ac、鼠抗PP2Ac一抗(ABCAM公司，均1∶2000)和兔抗β-actin一抗(SIGMA公司，1∶2000)，以及羊抗鼠680熒光二抗和羊抗兔800熒光二抗(LI-COR公司，均1∶5000)。應用Odyssey紅外成像系統(tǒng)(美國LI-CORBIOSCIENCES公司)成像，信號強度用Image J軟件(美國National Institutes of Health)分析，以β-actin作為內對照。

1.5 PP2A活性檢測

采用PP2A檢測試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)，用試劑盒中的細胞處理液收集細胞，提取蛋白，建立Bradford法測定蛋白濃度標準曲線和蛋白濃度測定。應用分光光度計分別測定樣品背景磷濃度、樣品總活性磷濃度、非特異活性磷濃度。計算樣品特異性活性。

1.6 統(tǒng)計學分析

數據用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計軟件進行處理。結果以(xˉ±s)表示，進行單因素方差分析(One-way ANOVA)。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 魚藤酮對細胞及PP2A活性的影響

2.1.1 細胞活力

加入10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L魚藤酮培養(yǎng)24 h，細胞活力分別為正常組的62.16%(F=27.000,P＜0.001)、 53.69%(F=27.000,P＜0.001)、 47.83%(F=27.000,P＜0.001)、 47.50%(F=27.000,P＜0.001)(圖1)。

2.1.2 Western blotting

加入10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L魚藤酮培養(yǎng)24 h，pY307-PP2Ac水平分別為正常組的99.62%、136.69%、190.20%、158.92%?？侾P2Ac水平無明顯改變(圖2～圖4)。

50 nmol/L魚藤酮組pY307-PP2Ac水平最高，故后續(xù)試驗魚藤酮濃度均為50 nmol/L。

圖1 各組MN9D細胞活力比較

圖2 Western blotting檢測結果

圖3 各組p Y307-PP2Ac水平比較

圖4 各組總PP2Ac水平比較

2.1.3 PP2A活性

魚藤酮組PP2A活性低于對照組(F=6.000,P=0.027)，見圖5。

圖5 各組PP2A活性比較

2.2 C2-神經酰胺對魚藤酮作用的影響

2.2.1 Western blotting

魚藤酮+C2組pY307-PP2Ac水平為正常組的99.95%，與魚藤酮組有非常顯著性差異(F=8.000,P=0.004)；各組間總PP2Ac水平無顯著性差異(圖6～圖8)。

圖6 Western blotting檢測結果

圖7 各組p Y307-PP2Ac水平比較

圖8 各組總PP2Ac水平比較

2.2.2 PP2A活性

魚藤酮+C2組PP2A活性高于魚藤酮組(F=4.600,P=0.024)。見圖9。

圖9 各組PP2A活性比較

2.2.3 細胞活力

魚藤酮+C2組細胞活力為正常組的74.47%，顯著高于魚藤酮組60.83%(F=28.000,P＜0.001)。圖10。

3 討論

本研究顯示，魚藤酮可通過提高pY307-PP2Ac水平，抑制MN9D細胞PP2A活性，并且這一作用有一定的濃度依賴性。

C2-神經酰胺是PP2A特異性激動劑，通過與PP2A催化亞基C相互作用實現對PP2A的激動[16]。5～20μmol/L神經酰胺可以激活PP2A三聚體[17]。C2-神經酰胺對PP2A的作用是特異的，其他神經酰胺不能激動PP2A[17]。本研究顯示，C2-神經酰胺可以改善魚藤酮造成的細胞PP2A活性下降，這一過程伴隨著pY307-PP2Ac水平下調。提示魚藤酮對pY307-PP2Ac進行調節(jié)，參與了魚藤酮誘導的PP2A活性下降。本實驗室此前在SK-N-SH細胞、大鼠原代神經元細胞中也發(fā)現相同的作用特點[18]。

神經系統(tǒng)退行性疾病是多因素交互作用的結果，如蛋白聚集、蛋白磷酸化、神經元功能缺失和死亡等。Kelvin C.Luk在野生型非轉基因鼠注射合成的α-syn纖維，發(fā)現會導致病理性α-syn絲氨酸129位磷酸化的細胞間傳遞，在解剖接近區(qū)域出現帕金森樣Lewy病理。絲氨酸129位磷酸化是α-syn的一種重要的翻譯后修飾形式。蛋白沉積與蛋白磷酸化具有相關性。α-syn的聚集受α-syn的翻譯后修飾影響[19]。α-syn絲氨酸129位磷酸化在體內和體外都通過增加α-syn的聚集而增加其毒性[2]。磷酸化修飾影響α-syn的聚集狀態(tài)[20]并控制其毒性[21]，使磷酸化α-syn成為帕金森病病理過程中的重要節(jié)點[22-23]。PP2A絲蘇氨酸磷酸酶對于保持α-syn絲氨酸129位磷酸化和去磷酸化的平衡極其重要。隨著研究進一步深入，環(huán)境因素與帕金森病重要病理成分的相關性將逐漸被闡明。

魚藤酮是一種線粒體復合酶Ⅰ抑制劑，影響細胞呼吸鏈，產生活性氧，對細胞造成毒性作用，常被用于復制帕金森病神經毒性模型[24]。本研究顯示，PP2A激動劑C2-神經酰胺在翻轉魚藤酮造成PP2A活性下降的同時，可一定程度改善魚藤酮造成的細胞活力下降，提示魚藤酮抑制PP2A活性參與魚藤酮對細胞活力的抑制。這可能與PP2A參與細胞生長和增殖、細胞凋亡、轉錄和翻譯等多種細胞生命活動有關[25-26]。已有研究表明，某些藥物以PP2A為靶向，激活PP2A能減少魚藤酮誘導的模型鼠運動障礙，并挽救黑質多巴胺能神經元的丟失[27]。

總之，本細胞學研究顯示，魚藤酮通過使PP2A催化亞基307位點酪氨酸發(fā)生磷酸化，抑制PP2A活性，PP2A激動劑C2-神經酰胺可以反轉魚藤酮引起的PP2A活性抑制及細胞活力抑制。進一步深入探討帕金森病的環(huán)境危險因素作用于α-syn的內在機制，將α-syn與PP2A相聯系，研究魚藤酮的毒性作用，有助于理解PP2A在帕金森病發(fā)病過程中的作用，并發(fā)現潛在的藥物干預位點。

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