史曉薇，郭 雄

(1.西安交大醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科,陜西 西安 710061；2.西安交通大學(xué)環(huán)境與基因教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室與公共衛(wèi)生學(xué)院地方病研究所，陜西 西安 710061)

大骨節(jié)病(Kashin-Beck disease，KBD)是一種以骺板和關(guān)節(jié)軟骨深層細(xì)胞壞死為特征的慢性地方性變形性骨關(guān)節(jié)病，主要分布在我國(guó)東北到西南的斜形低硒地帶。本病病程緩慢，KBD多在兒童期(5～13歲)發(fā)病，成人中新發(fā)病例甚少。本病至今原因未明，近年來(lái)對(duì)KBD的發(fā)病特點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)個(gè)體的易感性可能在KBD的發(fā)病中起一定的作用[1-2]。Ⅺ型膠原是軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白，在細(xì)胞外基質(zhì)中起重要的作用，Ⅺ型膠原參與其他軟骨特異性膠原(Ⅱ型和Ⅸ膠原)的纖維形成，并參與調(diào)節(jié)軟骨膠原原纖維的直徑。 較多研究發(fā)現(xiàn)COL11A1基因多態(tài)性與骨關(guān)節(jié)疾病相關(guān)，如：COL11A1 基因多態(tài)性與腰椎間盤突出癥(LDH)和腰椎間盤退變(LDD)有關(guān)；COL11A1的突變與骨關(guān)節(jié)炎(OA)的易感性相關(guān)。大骨節(jié)病是一種特殊類型的骨關(guān)節(jié)疾病，COL11A1基因多態(tài)性與KBD的易患性的研究較少，本研究欲通過(guò)對(duì)COL11A1基因多態(tài)性在KBD易感人群(兒童)中的關(guān)聯(lián)分析，探討COL11A1在KBD發(fā)病中的作用。

1對(duì)象和方法

1.1研究對(duì)象

按照我國(guó)《大骨節(jié)病診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS/T 207-2010)進(jìn)行KBD病例的診斷和排除[3]。從2015年6月至8月，共對(duì)陜西省麟游縣和永壽縣大骨節(jié)病區(qū)的119例無(wú)親緣關(guān)系(非三代以內(nèi)親屬)的兒童進(jìn)行研究，其中包括35例KBD兒童(KBD 組)和年齡、性別相匹配的84例健康兒童(對(duì)照組)。所有研究對(duì)象均進(jìn)行臨床和右手正位X片檢查，均排除了其它骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)疾病。在征得患者及家屬知情同意后抽取空腹靜脈血5mL。本研究得到了西安交大第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 SNPs基因分型

參照文獻(xiàn)相關(guān)研究報(bào)道[3-4]，選擇COL11A1基因的9個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行研究(位點(diǎn)信息見(jiàn)表1)，用GoldMag純化試劑盒(陜西北美基因股份有限公司生產(chǎn))提取全血基因組DNA，用Thermo Fish公司的NaNoDrop 2000c完成DNA濃度檢測(cè)。PCR引物是利用美國(guó)Sequenom公司的Assay Design 4.0進(jìn)行設(shè)計(jì)，使用美國(guó)Sequenom公司的MassArrayRS1000飛行質(zhì)譜平臺(tái)完成SNP(single nucleotide polymorphisms)分型的檢測(cè)，檢測(cè)數(shù)據(jù)由Sequenom公司的Typer4.0軟件進(jìn)行管理和分析的。

表1 COL11A1基因上9個(gè)被研究位點(diǎn)信息

Table 1 Loci information of the 9 studied SNPs in COL11A1 gene

SNP位點(diǎn)染色體位置等位基因aSNP位置MAFHEW檢驗(yàn)(P)rs1463048103124664T/CIntron0．3671．00rs2229783103125039G/Aexon0．3690．18rs1676486103126726G/Aexon0．2800．65rs3753841103152506A/Gexon0．3210．27rs4908273103153717C/TIntron0．2020．36rs1012282103199969A/GIntron0．1071．00rs1463035103222784T/CIntron0．0780．38rs2615977103224980A/CIntron0．1081．00rs1463034103227805T/CIntron0．0770．38

注：a指野生型等位基因/突變性等位基因。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各位點(diǎn)的基因型頻率在對(duì)照組中行Hardy Weinberg(HWE)檢驗(yàn)。用χ2檢驗(yàn)比較各SNP位點(diǎn)的等位基因頻率/基因型頻率在兩組中兒童的分布。用非條件Logistics回歸模型衡量各等位基因在3種遺傳模型(顯性、隱形和加和模型)下的效益，所有數(shù)據(jù)間的顯著性關(guān)系經(jīng)過(guò)年齡和性別校正后獲得[5]，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2結(jié)果

2.1研究對(duì)象一般資料

兩組兒童性別構(gòu)成(男/女：17/18 與 42/42)和平均年齡(11.30±6.79歲與11.97±7.85歲)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.02，t=0.58，均P>0.05)。35例KBD 兒童中32例為Ⅰ期患兒，3例為Ⅱ期患兒。

2.2 9個(gè)SNPs位點(diǎn)等位基因、基因型頻率分布

9個(gè)SNPs位點(diǎn)在84例正常兒童的HEW檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，均為P>0.05，表明分型結(jié)果符合遺傳學(xué)定律。9個(gè)SNPs 位點(diǎn)等位基因及基因型分布見(jiàn)表2，位點(diǎn)rs2229783等位基因頻率在兩組兒童中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，突變型等位基因A的頻率在病例組為18.6%(13/70)，顯著低于對(duì)照組的38.1%(64/168)(χ2=8.61，P<0.01)。 該位點(diǎn)病例組兒童GG/GA/AA基因型的頻率為65.7%(23/35)、31.4%(11/35)和2.9%(1/35)，與對(duì)照組的構(gòu)成比29.7%(25/84)、64.3%(54/84)和6.0%(5/84)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=21.5，P<0.05)。位點(diǎn)rs1676486中病例組兒童GG/GA/AA基因型的頻率為45.7%(16/35)、34.3%(12/35)和20.0%(7/35)，與對(duì)照組構(gòu)成比44.1%(37/84)、44.8%(41/84)和7.1%(6/84)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=10.4，P<0.05)。提示COL11A1基因多態(tài)性與兒童KBD 的易患性有關(guān)。

表2 兩組兒童等位基因和基因型頻率比較(%)

注：a野生型等位基因純和子/雜合子/突變型等位基因純合子。

2.3 SNP基因型與KBD 關(guān)聯(lián)分析

進(jìn)一步在顯性、隱形和加權(quán)3種遺傳模型下分析該基因突變與KBD 發(fā)病的關(guān)系，在經(jīng)過(guò)年齡、性別校正后發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)re2229783 在顯性和加權(quán)模型中的OR值小于1，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，說(shuō)明在相同致病環(huán)境中攜帶突變型等位基因A的個(gè)體患有KBD的風(fēng)險(xiǎn)降低。而位點(diǎn)rs1676486 在隱性模式下(OR=3.18，P<0.05)，提示在相同致病環(huán)境中，突變基因型AA的個(gè)體患有KBD的風(fēng)險(xiǎn)高于野生型等位基因G攜帶者即GG、GA基因型的個(gè)體，見(jiàn)表3。

表3 各位點(diǎn)3種遺傳模型分析的OR(95% CI)值

3討論

3.1 KBD的發(fā)生發(fā)展與環(huán)境易感基因有關(guān)，XI型膠原與骨軟骨病關(guān)系密切

KBD是一種以骺板和關(guān)節(jié)軟骨深層細(xì)胞壞死為特征的慢性地方性變形性骨關(guān)節(jié)病，主要分布在我國(guó)東北到西南的斜形低硒地帶。環(huán)境可疑致病因素、病理、生化表現(xiàn)及相同環(huán)境暴露下發(fā)病的個(gè)體差異提示KBD的發(fā)生發(fā)展可能與環(huán)境-基因相互作用有關(guān)，但相關(guān)的研究甚少，XI型膠原在骨軟骨性疾病發(fā)病中的作用已被廣泛認(rèn)可，KBD是具有特定地理分布的地方性骨關(guān)節(jié)病。本研究首次選擇COL11A1為候選基因，探討其在KBD易感性的作用。

3.2 兒童KBD 易患性與COL11A1基因多態(tài)性相關(guān)

KBD的病因不清，遺傳的多態(tài)性可能與個(gè)體的易感性有關(guān)[1-2]。在本研究中，分析了COL11A1基因上9個(gè)SNP與KBD易患性的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)COL11A1基因多態(tài)性在兒童KBD的患病風(fēng)險(xiǎn)中起著重要作用。COL11A1基因位點(diǎn)rs2229783的等位基因頻率和基因型頻率在兩組兒童中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且在顯性和加權(quán)遺傳模型下其OR值均小于1，提示在病區(qū)相同的致病環(huán)境中，rs2229783位點(diǎn)攜帶等位基因“A”的個(gè)體KBD的患病風(fēng)險(xiǎn)低于不攜帶等位基因“A”的個(gè)體。rs2229783是 位于OL11A1第62個(gè)外顯子，有研究發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)多態(tài)性與LDH的易感性有關(guān)[3]，然而rs2229783在骨關(guān)節(jié)病中的功能研究有限，其在KBD在中作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入，推測(cè)rs2229783的A等位基因誘導(dǎo)XI型膠原表達(dá)的相對(duì)增加，這種增加可能與降低KBD的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)COL11A1基因中另一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)rs1676486的基因型在兩組兒童中存在顯著性差異，且在隱性遺傳模式下OR=3.18，該結(jié)果提示在相同治病環(huán)境中，突變基因型AA的個(gè)體患有KBD的風(fēng)險(xiǎn)增高。有研究報(bào)道rs1676486 T等位基因?qū)е翪OL11A1 mRNA的合成和穩(wěn)定性降低，與骨軟骨疾病有關(guān)[4]，對(duì)應(yīng)的功能機(jī)制有待于在KBD患病中研究驗(yàn)證。

總之，通過(guò)本次研究發(fā)現(xiàn)COL11A基因多態(tài)性與兒童KBD 易患性有關(guān)，相關(guān)的結(jié)論有待于今后在其它人群和較大樣本量中研究驗(yàn)證。

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