陳云政

奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖中最常見多發(fā)的一種乳腺疾病，發(fā)病率高，危害極其嚴重，是造成奶牛業(yè)經濟損失的四大疾病之一?；疾∨Ｖ饕R床表現(xiàn)為產奶量減少、擠奶時明顯疼痛甚至拒絕擠奶。奶牛乳房炎是全世界奶牛養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的障礙，不僅使得奶牛發(fā)病后造成泌乳機能不同程度地下降，還對乳品質產生影響，甚至對人類的健康也帶來潛在的威脅。據統(tǒng)計我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)中乳房炎發(fā)病率在15%～40%左右，故對奶牛乳房炎必須予以重視，養(yǎng)殖場應加強防范和治療。奶牛乳房炎的病因很多，但與養(yǎng)殖環(huán)境中的病原微生物的侵入有直接的關系，研究發(fā)現(xiàn)奶牛乳腺炎主要發(fā)病原因是由鏈球菌、葡萄球菌和大腸桿菌等條件性致病菌引起的；此外氣候變更、外力及遺傳因素等都對乳房炎的誘發(fā)有一定的影響，如寒冷陰濕的季節(jié)發(fā)生率較高。本研究對2016年5月本地區(qū)某規(guī)模荷斯坦奶牛場患乳房炎的奶牛經治療后仍未痊愈的奶牛病例的鮮奶樣品中的病原菌進行了分離和鑒定，以期了解頑固病牛的病原菌感染情況，為尋找有效的治療及控制奶牛乳房炎的發(fā)生提供科學的依據。

1材料與方法

1.1材料

采自當?shù)啬衬膛龌既榉垦?、有臨床癥狀且已經局部和全身用藥治療但體溫仍偏高、泌乳量明顯少的泌乳奶牛乳區(qū)收集乳樣，同時收集健康乳區(qū)乳樣進行對照。

1.2主要試劑與儀器

麥康凱培養(yǎng)基、含4%牛血清及0.1%裂解血的培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基（包括7.5%甘露醇NaCl瓊脂、S.S.瓊脂、伊紅美蘭瓊脂等）、PCR Mix、16S通用引物、生化反應管；電熱恒溫培養(yǎng)箱、DYY-6C型電泳儀、PCR儀、凝膠成像儀等。

1.3乳樣的采集及處理

采集乳樣前應先將乳區(qū)及操作人員手部徹底消毒后，棄去前面流出的乳汁，然后在無菌乳區(qū)采集50mL左右的鮮乳置于無菌的離心管中并作好標記，低溫保存并快速送至實驗室進行相關試驗。

1.4乳樣細菌培養(yǎng)

無菌環(huán)境下將病牛和健康牛的乳樣分別涂在麥康凱培養(yǎng)基、含4%牛血清及0.1%裂解血的培養(yǎng)基及各種選擇培養(yǎng)基上后，將各培養(yǎng)基置于37～C電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察各培養(yǎng)基表面細菌的生長情況；

1.5菌落PCR鑒定及生化反應試驗

將含4%牛血清及0.1%裂解血的培養(yǎng)基及各種選擇培養(yǎng)基上的菌落溶解于無菌的生理鹽水中，煮沸10min后，應用16S通用引物進行PCR擴增，PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果顯示擴增的目的片段與預期的大小一致。將其送到上海生工測序，將測序結果與NCBI上公布的序列進行比對。將測序比對結果為葡萄球菌的接種于各生化反應發(fā)酵管，培養(yǎng)24h后，觀察結果。

2細菌分離培養(yǎng)結果

從兩份乳樣麥康凱培養(yǎng)基上均可見有磚紅色，圓形凸起的菌落，由此可見乳樣中均含有大腸桿菌；含4%牛血清及0.1%裂解血的培養(yǎng)基及各種選擇培養(yǎng)基上的菌落經16S PCR鑒定、序列比對及葡萄球菌生化反應試驗結果顯示兩份乳樣中共分離出細菌2種，其中葡萄球菌屬細菌共有5株，以金黃色葡萄球菌最多。

3小結與討論

本次試驗因病料采集數(shù)量有限，因此分離出的細菌種類及數(shù)量均不是很多，同時當前仍有很多細菌不能通過細菌培養(yǎng)的方式獲得，故存在部分致病菌的遺漏不能檢出。為全面獲得致病菌信息，在牛乳房炎的診治過程中，可考慮應用多重PCR及高通量測序進行鑒別。通常健康牛乳和患乳房炎病牛分泌的乳汁中細菌種類很多，但最常見乳房炎致病菌是大腸桿菌、乳房鏈球菌、克雷伯氏菌等，其次是停乳鏈球菌、化膿桿菌、金黃色葡萄球菌等，研究發(fā)現(xiàn)在健康或亞臨床乳樣中乳房鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌等細菌含量低于臨床型乳房炎，且健康乳樣中不含有大腸桿菌。但本次試驗在健康牛乳對照中也分離到了大腸桿菌，而乳房炎常見的病原菌如鏈球菌等均沒有分離到，分析原因可能是由于單純從臨床癥狀來判定是否患有乳房炎而導致，缺乏SCC等方法對隱性乳房炎的排除等。

奶牛乳房炎的危害性大、治愈困難，在實際生產中應堅持以“預防為主、早發(fā)現(xiàn)早治療”的原則預防控制乳房炎。奶牛乳房炎按臨床表現(xiàn)可分為急性型奶牛乳房炎、慢性型奶牛乳房炎和隱性乳房炎三種，及時治療是急性型乳房炎和慢性型乳房炎的關鍵措施，而隱性乳房炎應重點加強控制和預防工作。調查發(fā)現(xiàn)在各大養(yǎng)牛場中隱性乳腺炎普遍存在，其發(fā)病率可高達60%，隱性病例如不及時診治，易轉變成臨床型乳腺炎，帶來巨大的經濟損失，因此加強做好隱I生感染病例的診治預防工作，可以從根源上減少和杜絕致病微生物的存在，具有極為重要的現(xiàn)實意義。奶牛乳房炎絕大多數(shù)都是因為乳區(qū)感染致病細菌而導致，因此奶牛乳房炎防控應從飼養(yǎng)環(huán)境、病原菌來源等基本環(huán)節(jié)進行人工干預，如牛床設計合理、保持牛舍的環(huán)境衛(wèi)生、及時更換墊料和清理污水糞便、定期消毒等，通過加強牛群的飼養(yǎng)管理、凈化環(huán)境、補充營養(yǎng)物質、增強機體抗病力、淘汰陽性奶牛及加強疫苗免疫等措施降低乳腺炎的發(fā)生。對于微生物感染引發(fā)的乳腺炎在診治時應有針對性地選擇藥物和投藥方法，有條件的養(yǎng)殖場最好先進行藥敏試驗來篩選最佳藥物進行有效快速的治療。奶牛發(fā)生乳腺炎會直接影響乳汁品質，人類飲用后也會影響到人類的身體健康，對公共衛(wèi)生造成一定的威脅。應及時淘汰慢性或久治不愈的奶牛，防止病原微生物擴散，消除傳染源，因此養(yǎng)牛場應定期進行全場牛群乳房炎檢測工作及建立健全科學的疫病防御體系及檢疫制度，以便及時了解該病的流行情況，并提前提高奶牛的自然抗病能力，顯著降低乳房炎發(fā)病率。endprint