時(shí)方方 閆 偉 高鳳騰 王桂玲

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 泰安 271000)

半枝蓮為唇形科植物半枝蓮Scutellaria barbata D Don的干燥全草，味辛微苦，全草入藥。具有清熱解毒、化瘀利尿的功效，可用于疔瘡腫毒、咽喉腫痛、跌打傷痛、蛇蟲咬傷等，臨床研究證明還具有抗腫瘤作用。主要含有黃酮類、多糖類、二萜類等成分[1-4]。白花蛇舌草為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa willd[Oldenlandia d if f usa (Willd.) Rox b.]的干燥全草，性甘、寒、微苦，以全草入藥，主要功效是清熱、解毒、利濕。用于癰腫瘡癤、肺熱咳喘、毒蛇咬傷等，主要含有蒽醌類、黃酮類、生物堿類等成分[5-8]。半枝蓮和白花蛇舌草同屬清熱解毒類中藥，二者常以藥對(duì)形式出現(xiàn)在各種臨床應(yīng)用中。黃酮類化合物作為兩者主要的成分，近年來的研究證實(shí)具有抗菌消炎、清熱解毒、抗氧化等療效[9-10]。

本研究是以兩者共有的黃酮類化合物作為研究對(duì)象，以總黃酮的提取率為考察指標(biāo)，采用Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)選半枝蓮和白花蛇舌草藥對(duì)中總黃酮的提取工藝，本研究為半枝蓮和白花蛇舌草藥對(duì)中黃酮類成分的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供了參考和依據(jù)。

1 儀器、材料和試劑

1.1儀器

SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式多用真空泵(上?？婆d儀器有限公司)；KQ-5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UV-5200紫外-可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；MP-300D電子分析天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)；HH-2數(shù)星恒溫水浴鍋(金壇市城東新瑞儀器廠)。

1.2材料和試劑

半枝蓮(山東晟銀多寶中藥飲片科技有限公司)；白花蛇舌草(亳州市中正中藥材飲片有限公司)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)16031813，純度98%，中國(guó)百歐博偉生物技術(shù)有限公司)；三氯化鋁(上海廣諾化學(xué)科技有限公司)；水為純凈水，其它試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1含量測(cè)定

2.1.1對(duì)照品溶液的制備

精密稱量蘆丁對(duì)照品2 mg，甲醇溶解定容至10 ml量瓶中，配成濃度為0.2 mg·ml-1的溶液，備用。

2.1.2三氯化鋁溶液的制備

稱取適量三氯化鋁蒸餾水溶解定容至500 ml量瓶中，制成5%的三氯化鋁溶液，備用。

2.1.3測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

量取“2.1.1”項(xiàng)蘆丁對(duì)照品溶液1 ml,置于25 ml量瓶中，加入3 ml三氯化鋁溶液，甲醇定容，搖勻，靜置10 min，以不加對(duì)照品的溶液做為空白，在紫外分光光度儀上200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果顯示對(duì)照品溶液在414 nm出現(xiàn)最大吸收，因此確定最大吸收波長(zhǎng)為414 nm。

2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密移取“2.1.1”項(xiàng)蘆丁對(duì)照品溶液0 ml、0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml、1.4 ml、1.6 ml分別置25 ml量瓶中，各加入3 ml三氯化鋁溶液，甲醇定容，搖勻，靜置10 min，以不加對(duì)照品的溶液作空白，在414 nm處測(cè)定吸光度。以溶液的濃度C為橫坐標(biāo), 吸光度A為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程A=29.313C+0.005 R2=0.9996，表明蘆丁在0.0064～0.0128 mg·ml-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1不同配比的考察

將半枝蓮和白花蛇舌草以3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3不同比例分別稱取3 g，分別置于已編號(hào)的圓底燒瓶中，各加入20倍量體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，回流提取1.5 h。抽濾，濾液加水定容至100 ml量瓶中，混勻，移取適量溶液于坩堝中，蒸干，少量甲醇超聲溶解，轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶中，再加3ml的三氯化鋁溶液，甲醇定容至刻度，靜置10 min，在414 nm處測(cè)定吸光度。按“2.1.4”項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同配比對(duì)提取率的影響

從圖1可以看出，半枝蓮和白花蛇舌草配比不斷發(fā)生變化時(shí)，提取率呈明顯的下降趨勢(shì)，當(dāng)配比為3∶1和2∶1時(shí)，提取率都很高。但考慮到兩者在藥對(duì)中比例的均衡，故選擇半枝蓮和白花蛇舌草配比為2∶1。

2.2.2乙醇體積分?jǐn)?shù)的考察

在確定配比(2∶1)的條件下稱取半枝蓮和白花蛇舌草7份，每份3 g，分別置于已編號(hào)的圓底燒瓶中，各加入20倍量體積分?jǐn)?shù)為35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%的乙醇，回流提取1.5 h。余下操作同“2.2.1”項(xiàng)。結(jié)果如圖2所示。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

從圖2可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，黃酮的提取率呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢(shì)，在體積分?jǐn)?shù)為75%時(shí)達(dá)到最大，所以選擇體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇作為提取溶劑。

2.2.3料液比的考察

按配比(2∶1)稱取半枝蓮和白花蛇舌草6份，每份3 g，分別采用15、20、25、30、35、40倍量的75%乙醇，回流提取1.5 h。余下操作同“2.2.1”項(xiàng)。結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，隨著料液比倍數(shù)的增加，黃酮提取率也隨之增加，但當(dāng)料液比為25倍量后，增加幅度不明顯，故選擇料液比25倍量的為宜。

2.2.4提取時(shí)間考察

按配比(2：1)稱取半枝蓮和白花蛇舌草6份，每份3 g，采用25倍量的75%乙醇，分別提取0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h，余下操作同“2.2.1”項(xiàng)。結(jié)果如圖4所示。

從圖4可以看出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮提取率呈增加的趨勢(shì)，但當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到2 h后，增加幅度不明顯，故選擇提取時(shí)間為2h。

2.3Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化總黃酮的提取工藝

2.3.1設(shè)計(jì)方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用軟件Design-Expert8.05b中Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)模塊，綜合單因素考察的結(jié)果，選取配比(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、料液比(C)、提取時(shí)間(D)四個(gè)較為顯著的因素為自變量進(jìn)行優(yōu)化，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，分別用-1、0、1表示，以總黃酮的提取率(Y，mg·g-1)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，具體的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表1、2所示。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)自變量、水平表

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

2.3.2數(shù)據(jù)處理及模型擬合

利用Design-Expert8.05b軟件對(duì)上述表格中的數(shù)據(jù)分析，以總黃酮提取率為因變量，對(duì)作為自變量的因素(A、B、C、D)進(jìn)行二項(xiàng)式擬合，得到回歸方程Y=24.07+3052A-0.80B+0.92C+1.86D-0.50AB+0.69AC+0.49AD-1.06BC+0.12BD-1.07CD+0.72A2+0.31B2-0.17C2+1.50D2，R2=0.9878，由方程的相關(guān)系數(shù)可以看出，因變量和自變量擬合的二項(xiàng)式方程相關(guān)系數(shù)較高，擬合效果好。其方差(如表3所示)分析表明該模型具有顯著性(P<0.001)，失擬效果不顯著，各個(gè)因素的一次方對(duì)模型有顯著的影響。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明該擬合的方程的模擬效果較好，可以用于不同條件下的結(jié)果預(yù)測(cè)。

圖3 料液比對(duì)提取率的影響

圖4 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.3.3提取工藝的響應(yīng)面法分析及其優(yōu)化

采用Design-Expert8.05b軟件，根據(jù)擬合的二項(xiàng)式方程，繪制總黃酮提取率隨因素變化的等高線圖，以確定最佳的提取工藝條件。結(jié)果如圖5～8所示。從各因素的等高線圖5～8可以看出，配比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響基本呈一次關(guān)系，其中配比隨著半枝蓮所占比例的增加，總黃酮提取率呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì)；乙醇體積分?jǐn)?shù)隨著體積分?jǐn)?shù)的增加，呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)；料液比隨著倍數(shù)的增加也呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì)；提取時(shí)間隨著時(shí)間的延長(zhǎng)也呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì)。

圖5 配比對(duì)總黃酮提取率影響的等高線

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率影響的等高線

圖7 料液比對(duì)總黃酮提取率影響的等高線

圖8 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率影響的等高線

結(jié)合軟件中模型及相應(yīng)的等高線圖和曲面圖的分析結(jié)果：半枝蓮和白花蛇舌草總黃酮提取的最佳工藝參數(shù)為配比2.85∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)為65.15%、料液比為1∶28.09，提取時(shí)間為2.49 h,提取率為33.5839 mg·g-1。

2.3.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在此最佳工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(31.6467 mg·g-1、29.6025 mg·g-1、29.5457 mg·g-1，RSD=0. 51%，n=3)。平均提取率為30.2650 mg·g-1，與模型預(yù)測(cè)的結(jié)果接近，可以得到較高的總黃酮提取率，說明該模型可靠。

2.3.5提取次數(shù)的考察

稱取半枝蓮和白花蛇舌草共3 g，按照最佳工藝條件，配比2.85∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為65.15%，料液比為1∶28.09，回流提取2.49 h,提取率為33.5839 mg·g-1過濾，濾渣再加入相同體積的乙醇再提取一次，過濾，濾渣再加入相同體積的乙醇提取一次，共提取3次，每次濾液統(tǒng)一加蒸餾水定容到100 ml量瓶中，混勻，用移液管移取適量于坩堝中，蒸干，余下操作同“3.2.1”項(xiàng)。結(jié)果如圖9所示。

圖9 提取次數(shù)對(duì)提取率的影響

從圖9可以看出，隨著提取次數(shù)的增加，黃酮提取率呈明顯下降的趨勢(shì)，為了使提取完全以提取2次為宜。

2.3.6確定的提取工藝條件

綜合以上分析，確定最佳的提取工藝條件為半枝蓮和白花蛇舌草配比為2.85∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為65.15%，料液比為1∶28.09，回流提取2次，提取時(shí)間為2.49 h。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，3次測(cè)得的提取率接近。

3 討 論

效應(yīng)面法比正交實(shí)驗(yàn)法更簡(jiǎn)化比均勻設(shè)計(jì)更全面，試驗(yàn)精度高，并適用于多因素、多水平的試驗(yàn)。該設(shè)計(jì)法最大的優(yōu)點(diǎn)是可對(duì)未做過的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，但同時(shí)需要有豐富的專業(yè)知識(shí)和一定的預(yù)實(shí)驗(yàn)確定各因素的范圍，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于藥學(xué)研究領(lǐng)域。

Box-Behnken效應(yīng)面法確定最佳的提取工藝條件為半枝蓮和白花蛇舌草配比為2.85∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為65.15%，料液比為1∶28.09，回流提取2次，提取時(shí)間為2.49 h。Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)選的提取工藝簡(jiǎn)便可行，預(yù)測(cè)效果好，可以得到較高含量的黃酮，有一定的應(yīng)用前景。

[1] 鄭永紅，韋曉瑜，龍繼紅.半枝蓮的研究進(jìn)展[J].中草藥，2010，41(8)：1406-1408.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005 ：77-78.

[3] 張秀娟，楊珊珊.半枝蓮化學(xué)成分及提取物抗腫瘤作用的研究現(xiàn)狀[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，2008，4(8)：76-77.

[4] 楊連梅，劉量，胡榮，等.半枝蓮化學(xué)成份的提取和含量測(cè)定方法的研究[J].江蘇中醫(yī)藥，2010，42(2): 78-80.

[5] 紀(jì)寶玉，范重慶，裴莉昕，等.白花蛇舌草的化學(xué)成份及藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20(19)：235-240

[6] 斯建勇，陳迪華，潘瑞樂，等.白花蛇舌草中苷類成分的研究[J].中草藥，2008，39(4)：507-509.

[7] 劉盼盼，姚曉東，李潔.白花蛇舌草化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展.中國(guó)藥業(yè)，2011，20(21)：96-97.

[8] 羅金強(qiáng)，劉宏斌.半枝蓮、白花蛇舌草抗腫瘤的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2014,22(02) : 481-484.

[9] 陳莉華，張燁，李三艷.半枝蓮黃酮的超聲提取及其抗氧化活性[J].生物加工過程，2013，11(4)：36-41.

[10] 吳楊，周憶新，吳銀生.白花蛇舌草總黃酮的提取及體外對(duì)肝癌細(xì)胞的作用[J].抗感染藥學(xué)，2008，5(3) : 150-152.