劉 月， 李志濤， 李杰峰*， 趙志強， 劉軍峰， 林冬梅

（1.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北保定 071000；2.江南大學(xué)，江蘇無錫 214122；3.河北工程大學(xué)，河北邯鄲 056001）

菌糠的主要成分是棉籽皮、農(nóng)作物秸稈、玉米芯、鋸木屑及殘余菌絲體。目前，菌糠的處理方式大多數(shù)為焚燒或隨意丟棄，少數(shù)用于食用菌栽培的二次培養(yǎng)料或開發(fā)成肥料，極少部分開發(fā)用作動物的飼料補充料。研究表明，菌糠中含有大量的粗蛋白質(zhì)和豐富的糖類、有機酸類及其他營養(yǎng)物質(zhì)，另外，菌糠中還含有大量的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等抗?fàn)I養(yǎng)因子，這些成分難以被畜禽直接消化利用（潘軍，2010）。羅茂春等（2014）利用乳酸菌酵母菌制作白玉菇菌糠發(fā)酵飼料，菌糠發(fā)酵飼料的營養(yǎng)和感官品質(zhì)均得到較大改善；通過進行正交試驗，確定了最佳工藝條件為白玉菇菌糠：玉米粉 8∶1、發(fā)酵溫度 30 ℃、乳酸菌:酵母菌 1∶2、菌液接種量2.5%，在此條件下白玉菇菌糠粗蛋白質(zhì)含量為14.82%。張麗美等（2013）在菌糠中接入枯草芽孢桿菌對其發(fā)酵后，枯草芽孢桿菌的芽孢數(shù)為8×109cfu/g干重。靈芝收菇后的菌糠污染率小、獲得率高，而且僅收一潮菇，菌糠中養(yǎng)分剩余率高、具有較豐富的碳源與氮源等特點。因此，本試驗選取靈芝菌糠作為研究對象，將靈芝菌糠與玉米粉混合搭配，接入假絲酵母菌和嗜酸乳桿菌混合菌液，進行厭氧發(fā)酵。通過Plackett－Burman與中心復(fù)合試驗優(yōu)化其發(fā)酵條件，為菌糠的合理開發(fā)提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 靈芝菌糠：邯鄲市榮珍食用菌合作社提供。

菌種：高活性干酵母粉由安琪酵母股份有限公司提供，粉末固體，活菌量＞4×109cfu/g。嗜酸乳桿菌粉由常州生物科技有限公司提供，粉末狀固體，活菌量＞4×109cfu/g。

發(fā)酵袋：具有單向排氣閥裝置，規(guī)格30 cm×20 cm，袋裝容量1000 g。

1.2 靈芝菌糠營養(yǎng)成分分析 收集無污染、無霉變的靈芝菌糠進行粗蛋白質(zhì)、粗纖維、粗脂肪、無氮浸出物、鈣、磷和灰分測定。測定方法依據(jù)國標(biāo)和飼料分析檢測常規(guī)方法進行。

1.3 靈芝菌糠發(fā)酵飼料制備

1.3.1 菌糠預(yù)處理 將選取的靈芝于65℃烘干、粉碎后過60目篩孔篩選，按比例加入玉米粉充分混合，將其作為發(fā)酵原料，121℃高壓滅菌30 min后，裝入發(fā)酵袋中待用。

1.3.2 菌液制備 假絲酵母菌液制備方法：配質(zhì)量濃度為5 g/L葡萄糖活化溶液，調(diào)溫至35℃，將高活性干酵母粉按照質(zhì)量比溶解于活化液中，在33～35℃下活化1 h，得到假絲酵母菌液。

嗜酸乳桿菌液制備方法：配質(zhì)量濃度為5 g/L葡萄糖活化溶液，調(diào)溫至40℃，將嗜酸乳桿菌粉按照質(zhì)量比溶解于活化液中，在37～40℃下活化30 min，得到嗜酸乳桿菌液。

混合菌液制備：將假絲酵母菌液和嗜酸乳桿菌液按照質(zhì)量比混合均勻，得到混合菌液。

1.3.3 發(fā)酵 在發(fā)酵袋中按比例接入混合菌液，并按比例補充水分，調(diào)節(jié)pH，密封后在設(shè)定溫度下發(fā)酵，按時取樣測定，檢驗發(fā)酵效果。

1.4 方法

1.4.1 Plackett-Burman試驗關(guān)鍵因子篩選 采用Plackett-Burman設(shè)計法對影響靈芝菌糠發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)含量的9個影響因素進行篩選，選用試驗次數(shù)N＝12的試驗設(shè)計，其9個影響因素分別為：靈芝菌糠和玉米粉質(zhì)量比（X1）、假絲酵母菌液和嗜酸乳桿菌液質(zhì)量比（X2）、菌液接種量（X3）、發(fā)酵袋裝量（X4）、料水比（X5）、初始 pH（X6）、發(fā)酵溫度（X7）、發(fā)酵濕度（X8）和發(fā)酵時間（X9），響應(yīng)值為靈芝菌糠發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)含量。各因素及其代碼、編碼水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計因素及代碼水平

1.4.2 最陡爬坡試驗 響應(yīng)面擬合方程只有在接近最佳值區(qū)域才近似真實情況，因此要先逼近此區(qū)域才能建立有效的響應(yīng)面擬合方程，通常用最陡爬坡法快速的逼近最佳值區(qū)域。最陡爬坡法以Plackett-Burman試驗結(jié)果為依據(jù)，爬坡路徑與主要因素的效應(yīng)一致（張曉萍，2010）。

1.4.3 發(fā)酵條件的中心組合優(yōu)化 采用響應(yīng)面中心組合設(shè)計（Box-Behnken design），對靈芝菌糠發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)含量的顯著影響因子進一步優(yōu)化，根據(jù)Plackett-Burman和最陡爬坡法試驗結(jié)果，結(jié)合因素的效應(yīng)大小和試驗中的實際情況，選擇下一步試驗水平的中心點和各水平的步長（夏海濤，2014； 李 立 英 ，2012； 王 普 ，2006；Kalil，2000；Davies，1967），響應(yīng)值為靈芝菌糠粗蛋白質(zhì)含量，各因子和代碼水平見表2。

表2 Box-Behnken design試驗設(shè)計因素及代碼水平

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗關(guān)鍵因子篩選 運用SAS軟件對Plackett-Burman設(shè)計進行分析，由試驗設(shè)計和結(jié)果（表3）及各因素水平和結(jié)果（表4）得知，模型 Pr＞F=0.048538＜0.05，表明響應(yīng)面回歸模型為顯著水平，模型的校正系數(shù)R2＝0.9890，說明該模型方程擬合程度良好。模型的修正系數(shù)R2Adj=0.9395，表明該模型較好地反映了各因素之間的關(guān)系。各因素對靈芝菌糠粗蛋白質(zhì)含量的影響大小依次為：X5、X6、X3、X2、X4、X9、X1、X8、X7（按回歸系數(shù)絕對值大小排序），其中 X2、X3、X5、X6為顯著水平，X1、X2、X3、X7、X8呈正效應(yīng)， 而 X4、X5、X6、X9呈負效應(yīng)。因此確定 X2、X3、X5、X6為 4 個主要因素進行最陡爬坡試驗和Box-Behnken試驗設(shè)計。Plackett-Burman試驗設(shè)計回歸方程為：

Y=17.03899+0.451667X2+0.175X3-0.634667X5-0.788889X6。

2.2 最陡爬坡試驗 根據(jù)Plackett-Bueman試驗篩選出的4個主要因素回歸系數(shù)效應(yīng)值的正負大小，設(shè)計爬坡方向和步長進行最陡爬坡試驗以逼近最大區(qū)域。試驗設(shè)計及結(jié)果如表5所示，由表5可知，靈芝菌糠粗蛋白質(zhì)含量在試驗5附近，故以第5組試驗條件為水平中心點進行響應(yīng)面設(shè)計。

2.3 發(fā)酵條件中心組合優(yōu)化 在最陡爬坡試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，選取X2、X3、X5、X6進行4因素3水平的響應(yīng)面分析方法，以靈芝菌糠粗蛋白質(zhì)含量為響應(yīng)值，結(jié)果見表6。

采用SAS軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，由此可求出影響因素的一次效應(yīng)、二次效應(yīng)及其交互效應(yīng)的關(guān)聯(lián)式，得到回歸方程式：

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果

表4 Plackett-Bueman設(shè)計回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗

表5 爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果

Y=-365.087+26.71917X2+23.1125X3+19.37X5+74.25X6-1.873333X2X2+0.64X2X3-1.08X2X6-1.584583X3X3-1.145X3X6-0.046383X5X5-5.753333X6X6。

對該回歸模型進行方差分析，結(jié)果如表7所示，由此可知模型Pr>F=0.0001，表明響應(yīng)面回歸模型達到了極顯著水平，模型的校正系數(shù)R=0.9566，說明該方程擬合程度良好。模型的修正系數(shù)R2Adj=0.9059，表明該模型較好地反映了各因素之間的關(guān)系。通過對回歸方程的方差分析得出，一次項 X2、X3、X5、X6，二次項 X22、X32、X52、X62和交互項X2X3、X2X6、X3X6對靈芝菌糠粗蛋白質(zhì)含量的影響是顯著的，各試驗因子對靈芝菌糠粗蛋白質(zhì)含量的影響為非線性關(guān)系。

表6 Box-Behnken design試驗設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)上述回歸方程和回歸模型方差分析繪出響應(yīng)曲面，見圖1。兩因素之間的影響呈拋物線型關(guān)系，且均有一個極大值點，變化趨勢先增大后減小。通過求解回歸方程得到靈芝菌糠發(fā)酵飼料的最佳工藝是：假絲酵母菌液和嗜酸乳桿菌液用量比6.781108∶1、菌液接種量6.774657%、料水比1.139045∶1和初始 pH 5.159828，靈芝菌糠粗蛋白質(zhì)含量的預(yù)測值為14.883813%。考慮到實際操作，將試驗的條件修改為假絲酵母菌液和嗜酸乳桿菌液用量比6.8∶1、菌液接種量6.8%、料水比1.1∶1 和初始 pH 5.2。

表7 回歸模型方差分析

2.4 優(yōu)化條件下靈芝菌糠發(fā)酵飼料驗證結(jié)果在最佳組合條件下重復(fù)試驗3次，測定實際靈芝菌糠粗蛋白質(zhì)含量為14.51%，與預(yù)測值14.88%基本吻合，偏差較小，說明得到的回歸模型和實際情況擬合較好，進一步驗證了該模型的可行性具有實用價值。靈芝菌糠發(fā)酵前與發(fā)酵后營養(yǎng)含量和感官品質(zhì)對比如表8所示。

3 討論

本文通過以靈芝菌糠為發(fā)酵原料，接入混合菌種進行厭氧發(fā)酵，研究其制作發(fā)酵飼料的工藝條件。通過響應(yīng)面分析法中Plackett-Burman試驗設(shè)計，對影響靈芝菌糠發(fā)酵效果的諸多相關(guān)因素進行分析并成功篩選出主效應(yīng)因子，在Plackett-Burman設(shè)計基礎(chǔ)上，根據(jù)主效應(yīng)因子作用大小與方向進行爬坡試驗，得到以假絲酵母菌液和嗜酸乳桿菌液用量比6∶1、菌液接種量6%、料水比1∶1和初始pH 5為水平中心點進行響應(yīng)面設(shè)計。通過Box-Behnken design中心復(fù)合試驗，對主效應(yīng)因子進一步優(yōu)化。得到假絲酵母菌液和嗜酸乳桿菌液用量比、菌液接種量、料水比和初始pH對靈芝菌糠中粗蛋白質(zhì)含量影響的最佳值。

經(jīng)對靈芝菌糠發(fā)酵得到的熟料干燥后制成飼料顆粒成品進行營養(yǎng)成分分析，結(jié)果表明，除灰分幾乎無變化外，其粗纖維由40.11%下降到29.85%，粗蛋白質(zhì)由8.75%升高至14.51%，無氮侵出物由22.19%升高至25.92%。由此表明，靈芝菌糠經(jīng)微生物發(fā)酵后，粗纖維可轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)和單糖等無氮侵出物。因此，菌糠中粗蛋白質(zhì)、無氮侵出物顯著提高。

圖1 試驗因子交互作用對粗蛋白質(zhì)含量的影響

利用菌糠制作發(fā)酵飼料，因選擇的菌種組合、接種量和發(fā)酵條件等的不同，生產(chǎn)的發(fā)酵飼料營養(yǎng)成分差異較大。飼料加工、貯存和動物種類以及飼養(yǎng)條件等因素也存在差異，菌糠發(fā)酵飼料的實際應(yīng)用效果差異也會很大。因此，篩選繁殖、抗雜菌能力強并對粗纖維有強大分解能力的菌種對不同菌糠發(fā)酵，研究其有效成分，并對菌糠發(fā)酵飼料適用動物種類以及添加量進行深入研究。

表8 靈芝菌糠發(fā)酵前后的營養(yǎng)價值表（烘干后測定）

4 結(jié)論

靈芝菌糠制作發(fā)酵飼料最佳制備工藝條件為假絲酵母菌液和嗜酸乳桿菌液用量比6.8∶1、菌液接種量6.8%、料水比1.1∶1和初始pH 5.2。在此條件下測得菌糠發(fā)酵飼料中粗蛋白質(zhì)含量為14.51%，與理論預(yù)測值相比，相對誤差僅為0.37%，說明模型能較好地預(yù)測靈芝菌糠發(fā)酵飼料粗蛋白質(zhì)含量的實際情況，具有較好的生產(chǎn)指導(dǎo)意義。

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