徐曉鋒， 金亞?wèn)|， 張力莉， 王 芬， 張珠明

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021；2.北京英惠爾生物科技有限公司，北京海淀 100083）

有研究發(fā)現(xiàn)，給反芻動(dòng)物飼喂酵母培養(yǎng)物會(huì)降低其糞便中大腸桿菌的數(shù)量，增加有益菌群的數(shù)量，并且越早的飼喂動(dòng)物酵母培養(yǎng)物，越有利于酵母培養(yǎng)物作用的發(fā)揮 （Swyers等2014）。另外，研究表明，飼喂酵母培養(yǎng)物能夠提高動(dòng)物的采食量，增強(qiáng)機(jī)體免疫力等（Gerritsen等，2012）。本文旨在研究酵母培養(yǎng)物不同添加方式對(duì)犢牛生長(zhǎng)性能、糞便菌群以及機(jī)體免疫力的影響，從而為實(shí)際生產(chǎn)養(yǎng)殖提供理論依據(jù)，以期通過(guò)營(yíng)養(yǎng)調(diào)控與飼養(yǎng)管理來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)哺乳期犢牛以及后備牛培育質(zhì)量的提升。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)于2015年9～11月份，在寧夏平吉堡奶牛場(chǎng)進(jìn)行。采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，按出生日齡、體重相近原則選擇28頭健康狀況良好的荷斯坦公犢牛，隨機(jī)分為4組，每組7個(gè)重復(fù)，Ⅰ組為對(duì)照組，飲用乳及日糧中均不添加酵母培養(yǎng)物；Ⅱ組在飲用乳中添加20 g酵母培養(yǎng)物，日糧中不添加酵母培養(yǎng)物；Ⅲ組在日糧中添加20 g酵母培養(yǎng)物，飲用乳中不添加酵母培養(yǎng)物；Ⅳ組在飲用乳和日糧中各添加10 g酵母培養(yǎng)物。

酵母培養(yǎng)物由北京英惠爾生物科技股份有限公司提供。

1.2 飼養(yǎng)管理 犢牛出生后及時(shí)清除全身黏液，并對(duì)其進(jìn)行斷臍和臍帶藥浴消毒。在犢牛出生2 h內(nèi)，按其體重的8%飼喂初乳。待其可以站立后，將其移入1.5×3.0 m2犢牛島內(nèi)。每天分兩次飼喂混合牛乳，分別為早上7:00和下午6:00。各組犢牛的牛乳飼喂量一致，1周齡4 kg/d·頭；2周齡 5 kg/d·頭；3周齡 6 kg/d·頭；4 ～ 8周齡 7 kg/d·頭。開(kāi)食料及飲水任其自由采食。試驗(yàn)于第7天正式開(kāi)始，整個(gè)試驗(yàn)周期為56 d，整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)定期對(duì)犢牛島進(jìn)行消毒處理。開(kāi)食料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 開(kāi)食料組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.3.1 生長(zhǎng)性能統(tǒng)計(jì) 分別于試驗(yàn)第0、21、42、56天晨飼前測(cè)定各組犢牛的體重；同時(shí)在當(dāng)天測(cè)定每頭犢牛的胸圍、體斜長(zhǎng)和體高，用以計(jì)算體軀指數(shù)和體長(zhǎng)指數(shù)，計(jì)算公式如下：

體長(zhǎng)指數(shù)/%=體斜長(zhǎng)/體高×100；體軀指數(shù)/%=胸圍/體斜長(zhǎng)×100。

每天統(tǒng)計(jì)每頭牛的采食量；并分別記錄各組犢牛腹瀉頭數(shù)以及腹瀉天數(shù)，用以計(jì)算每組犢牛的腹瀉指數(shù)，計(jì)算公式如下：

腹瀉指數(shù)=（腹瀉頭數(shù)×腹瀉天數(shù)）/（試驗(yàn)天數(shù)×試驗(yàn)頭數(shù)）。

1.3.2 直腸大腸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量的測(cè)定在犢牛21日齡和56日齡，分別從每組選取3頭犢牛，用無(wú)菌塑料小勺從犢牛直腸內(nèi)取其糞便，裝入無(wú)菌試管中，并立即封口，在30 min內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。在無(wú)菌操作環(huán)境內(nèi)，分別取糞樣1 g，裝入盛有9 mL生理鹽水的無(wú)菌稀釋管中，在漩渦振蕩器上振蕩2～3 min，將其配制成1∶10的勻漿稀釋液；用移液槍取該勻漿液1 mL加入盛有9 mL生理鹽水的稀釋管內(nèi)，用漩渦振蕩器振蕩1～2 min，配制成10-2的稀釋液，再按照上述方法配制10-3～10-5的稀釋液備用。

選取適宜的稀釋度，分別涂布在伊紅美藍(lán)選擇性培養(yǎng) （EMB）和雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基（BBL）表面（兩種培養(yǎng)基均購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司），每個(gè)梯度做3個(gè)平行。將接種過(guò)的大腸桿菌培養(yǎng)皿倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，在有氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h；雙歧桿菌采用李伏夫法，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)72 h。以1 g腸道內(nèi)容物中細(xì)菌個(gè)數(shù)的對(duì)數(shù) （lg cfu/g）來(lái)表示糞便中細(xì)菌數(shù)量。

1.3.3 血清樣品采集與指標(biāo)測(cè)定 分別與試驗(yàn)的第21天以及第56天晨飼前用含肝素鈉的真空采血管頸靜脈采血5 mL，室溫下靜置30 min，然后3000 r/min離心15 min，取血清裝入1.5 mL的凍存管中，-20℃下保存?zhèn)錅y(cè)血清中IgA、IgG、IgM、IL-1β和TNF-α的濃度。血清中各免疫指標(biāo)濃度的測(cè)定，均采用牛免疫球蛋白雙抗一步夾心ELISA法，并嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)上的操作步驟進(jìn)行規(guī)范操作，所有試劑盒均夠自南京建成生物工程研究所。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 用Excel 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行基本的分類(lèi)統(tǒng)計(jì)，然后用SAS 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行深度分析。以P＜0.05作為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來(lái)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母培養(yǎng)物對(duì)犢牛生長(zhǎng)性能的影響

2.1.1 酵母培養(yǎng)物對(duì)犢牛體尺指數(shù)的影響 由表2可知，在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，犢牛體軀指數(shù)的組間差異不顯著（P＞0.05）；并且犢牛體軀指數(shù)的變化不受試驗(yàn)天數(shù)的影響（P>0.05）。而犢牛體長(zhǎng)指數(shù)則隨著試驗(yàn)天數(shù)的延長(zhǎng)而增加，天數(shù)對(duì)犢牛體長(zhǎng)指數(shù)的增加有顯著的影響 （P＜0.05）；但各處理組間的體長(zhǎng)指數(shù)差異不顯著（P>0.05）。試驗(yàn)后期，試驗(yàn)組的體長(zhǎng)指數(shù)較對(duì)照組均有一定的增加，但差異不顯著（P>0.05）。表明添加酵母培養(yǎng)物對(duì)提高犢牛的體長(zhǎng)指數(shù)有一定的作用。

表2 酵母培養(yǎng)物對(duì)犢牛體尺指數(shù)的影響

2.1.2 酵母培養(yǎng)物對(duì)犢牛采食量、日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率的影響 由表3可知，在0～21 d這一階段，各試驗(yàn)組ADMI量均高于對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05）；而ADG除Ⅱ組高于Ⅰ組外，Ⅲ組和Ⅳ組均低于Ⅰ組，各處理組間差異不顯著（P＞0.05）；此階段的F/G則是以Ⅱ組為最低，Ⅰ組次之，各處理組間差異不顯著（P＞0.05）。在22～42 d這一階段，各試驗(yàn)組ADMI和ADG均高于對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05）；此階段的F/G則是以Ⅳ組為最低，Ⅱ組次之，各試驗(yàn)組F/G均低于Ⅰ組，但差異不顯著（P＞0.05）。在43～56 d這一階段中，各試驗(yàn)組ADMI均高于Ⅰ組，但差異不顯著（P＞0.05）；除Ⅳ組外，此階段各試驗(yàn)組ADG均高于Ⅰ組，但差異不顯著（P＞0.05）；此階段，各試驗(yàn)組F/G均低于Ⅰ組，各處理組間差異不顯著（P＞0.05）。在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，各試驗(yàn)組ADMI分別比對(duì)照組提高8.95%、15.19%和10.89%（P＞0.05）；各試驗(yàn)組ADG分別比對(duì)照組提高24.83%、21.48%和19.46%（P＞0.05）， 各試驗(yàn)組F/G分別比對(duì)照組降低12.00%、5.33%和8.00%（P ＞ 0.05）。

2.2 酵母培養(yǎng)物對(duì)犢牛糞便中細(xì)菌數(shù)量的影響由表4可知，在試驗(yàn)第21天時(shí)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組糞樣中的大腸桿菌的數(shù)量顯著低于Ⅰ組（P＜0.05），3個(gè)試驗(yàn)組中大腸桿菌數(shù)以Ⅱ組為最低，各試驗(yàn)組大腸桿菌數(shù)無(wú)顯著差異（P＞0.05）；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組糞樣中雙歧桿菌的數(shù)量顯著高于Ⅰ組 （P＜0.05），各試驗(yàn)組雙岐桿菌數(shù)無(wú)顯著差異 （P＞0.05），但Ⅱ組的雙歧桿菌數(shù)在3個(gè)試驗(yàn)組中為最高。在試驗(yàn)第55天，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組糞樣中雙歧桿菌的數(shù)量略高于Ⅰ組，但無(wú)顯著差異 （P＞0.05）；而糞樣中大腸桿菌數(shù)則是Ⅰ組最高，且顯著高于試驗(yàn)Ⅱ組（P＜0.05），各試驗(yàn)組間大腸桿菌數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，試驗(yàn)組犢牛腹瀉指數(shù)分別比對(duì)照組降低88.89%、78.89%和83.33%。

表3 酵母培養(yǎng)物對(duì)犢牛平均日增重、采食量和料重比的影響

表4 酵母培養(yǎng)物對(duì)犢牛糞便微生物菌群的影響

2.3 酵母培養(yǎng)物對(duì)犢牛血清免疫指標(biāo)的影響由表5可知，在試驗(yàn)開(kāi)始的第21天，各試驗(yàn)組犢牛血清中IgA的濃度均高于Ⅰ組 （P＜0.05），且各試驗(yàn)組間差異均不顯著（P＞0.05）;與Ⅰ組相比，試驗(yàn)組IgA的濃度分別提高22.23%、10.12%、9.52%。血清中IgM的變化規(guī)律與IgA一致；與Ⅰ組相比，各試驗(yàn)組IgM的濃度分別提高18.21%、9.59%、6.14%（P＜ 0.05）。在試驗(yàn)的第21天，各試驗(yàn)組犢牛血清中IgM的濃度均高于Ⅰ組，且Ⅱ組和Ⅳ組血清中IgM的濃度顯著高于Ⅰ組（P＜0.05），而Ⅲ組血清中IgM的濃度與Ⅰ組差異不顯著 （P＞0.05）；各試驗(yàn)組血清中IgM的濃度分別比Ⅰ組提高21.05%、3.07%、9.81%。各試驗(yàn)組血清中IL-1β的濃度均高于Ⅰ組，且差異顯著（P＜0.05）；Ⅱ組與Ⅲ組和Ⅳ組間差異不顯著（P＞0.05），但Ⅲ組和Ⅳ組間的差異顯著 （P＜0.05）；各試驗(yàn)組分別比對(duì)照提高24.02%、32.90%、22.13%。各處理組間血清中TNF-α的濃度無(wú)顯著差異；各試驗(yàn)組TNF-α濃度分別比Ⅰ組提高10.14%、15.31%、15.31%。

在試驗(yàn)開(kāi)始的第55天，各處理組血清中I-gA、IgM、IgG和IL-1β濃度之間的差異不顯著；且Ⅱ組和Ⅲ組IgA、IgM、IgG和IL-1β均高于Ⅰ組；而Ⅳ組除IgA濃度比Ⅰ組高外，其IgM和IgG濃度分別比Ⅰ組降低0.23%和3.05%。試驗(yàn)組血清中TNF-α的濃度均低于Ⅰ組，各試驗(yàn)組間差異不顯著（P＞0.05）；Ⅰ組與Ⅱ組和Ⅲ組間差異顯著 （P＜0.05）；與Ⅰ組相比，各試驗(yàn)組TNF-α的濃度分別降低10.18%、9.92%、7.58%。

3 討論

3.1 酵母培養(yǎng)物對(duì)犢牛生長(zhǎng)性能的影響 體軀指數(shù)是用來(lái)反映軀體容量的相對(duì)發(fā)育情況，而體長(zhǎng)指數(shù)是用來(lái)反映體格長(zhǎng)度和高度的相對(duì)發(fā)育情況。體長(zhǎng)指數(shù)以及體軀指數(shù)主要受遺傳因素的影響，但后天管理水平對(duì)其也有一定程度的影響。犢牛體軀指數(shù)受外界影響較小，但體長(zhǎng)指數(shù)則與后期的飼養(yǎng)管理之間有密切關(guān)系。如果犢牛在生長(zhǎng)發(fā)育期的管理水平過(guò)低，就會(huì)造成犢牛生長(zhǎng)發(fā)育不完全，其體長(zhǎng)指數(shù)就會(huì)低于同期牛群體長(zhǎng)指數(shù)的平均值。犢牛在哺乳早期時(shí)，其身體發(fā)育的重點(diǎn)是骨骼，中期則為體長(zhǎng)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加酵母培養(yǎng)物提高了犢牛的ADMI及飼料轉(zhuǎn)化效率，相對(duì)的提高了犢牛的營(yíng)養(yǎng)水平，滿(mǎn)足了自身生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需要，從而促進(jìn)了其體尺的發(fā)育。

眾多研究表明，飼喂動(dòng)物酵母培養(yǎng)物可以提高動(dòng)物的ADMI、F/G以及ADG。Tripathi研究發(fā)現(xiàn)，添加酵母培養(yǎng)物可以提高羔羊的日采食量（Tripathi等，2010）；耿春銀（2015）認(rèn)為，添加酵母培養(yǎng)的并非增加了犢牛采食量本身，而是增加了犢牛的采食次數(shù)（耿春銀等，2015）。因?yàn)樘砑咏湍概囵B(yǎng)物會(huì)縮短犢牛的采食間隔，其采食頻率有一定程度的增加。本研究結(jié)果表明，添加酵母培養(yǎng)對(duì)犢牛飼料轉(zhuǎn)化率產(chǎn)生了積極影響。添加酵母培養(yǎng)物可以增加瘤胃揮發(fā)酸的濃度（Santos等，2015），而揮發(fā)酸中的乙酸和丁酸可以促進(jìn)瘤網(wǎng)胃的發(fā)育（Mentschel等，2001），進(jìn)而增加犢牛對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，添加酵母培養(yǎng)物組的犢牛腹瀉發(fā)生率低于Ⅰ組，這就減少了犢牛因?yàn)楦篂a而造成的營(yíng)養(yǎng)損失，相對(duì)增加了犢牛飼料的轉(zhuǎn)化效率；而犢牛腹瀉率的降低，則相對(duì)提高了犢牛的采食欲望，從而增加了犢牛的ADMI。犢牛ADG的提高，則是其采食量以及飼料轉(zhuǎn)化效率都提高的必然結(jié)果。

表5 酵母培養(yǎng)物對(duì)犢牛血清免疫指標(biāo)的影響

3.2 酵母培養(yǎng)物對(duì)犢牛糞便菌群個(gè)數(shù)的影響犢牛在哺乳早期，由于自身免疫力低下，加上飲用牛乳由初乳過(guò)渡到常乳，還有外界的各種應(yīng)激環(huán)境，極易造成犢牛腸道菌群的紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致腹瀉的發(fā)生。而引起犢牛腹瀉的常見(jiàn)致病菌為大腸桿菌。研究表明，酵母培養(yǎng)物能促進(jìn)動(dòng)物腸道有益菌群的增殖，并降低致病菌的數(shù)量（Magalhaes 等，2008），從而減小動(dòng)物腹瀉發(fā)生的幾率。而酵母培養(yǎng)物作用的發(fā)揮，則主要依賴(lài)于其細(xì)胞壁中的甘露寡糖和β-葡聚糖兩種成分（Jensen 等，2008；Fonty 等，2006）。 研究發(fā)現(xiàn)，酵母細(xì)胞壁以及其中所含的甘露寡糖對(duì)外源致病菌有一定的吸附作用（Perez-Sotelo等，2005），酵母培養(yǎng)物通過(guò)甘露寡糖實(shí)現(xiàn)對(duì)致病菌的特異性結(jié)合（White等，2002），競(jìng)爭(zhēng)性的抑制病原菌在腸道的定植（Daudelin等，2011），并降低腸道pH，避免致病菌通過(guò)腸道進(jìn)入機(jī)體從而誘發(fā)腹瀉；同時(shí)酵母培養(yǎng)物中的甘露寡糖和β-葡聚糖，還可作為腸道有益菌群如乳酸桿菌和雙岐桿菌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而促進(jìn)腸道有益菌的增長(zhǎng)，相對(duì)的降低大腸桿菌等致病菌群的數(shù)量。

本研究發(fā)現(xiàn)，飼喂?fàn)倥＝湍概囵B(yǎng)物可降低犢牛腹瀉發(fā)生率，并且哺乳早期在牛奶中添加酵母培養(yǎng)對(duì)糞便菌群的影響優(yōu)于其他兩種添加方案。Ⅱ組對(duì)糞中雙岐桿菌的數(shù)量增高百分?jǐn)?shù)，分別比Ⅲ組和Ⅳ組高 1.3%、1.4%（P＜0.05）；而對(duì)糞中大腸桿菌的降低百分?jǐn)?shù)分別比Ⅲ組和Ⅳ組高2.2%、1.1%。其原因可能是，在牛奶中添加酵母培養(yǎng)物增加了酵母培養(yǎng)物與瘤胃壁的接觸面積，從而增強(qiáng)了酵母培養(yǎng)物作用的發(fā)揮，進(jìn)而促進(jìn)了瘤胃微生物區(qū)系的建立，增加了瘤胃的消化能力，同時(shí)優(yōu)化了后端腸道的菌群。

3.3 酵母培養(yǎng)物對(duì)犢牛血清免疫物質(zhì)含量的影響 犢牛出生后，其機(jī)體免疫獲得方式轉(zhuǎn)變?yōu)楸粍?dòng)獲得。在其機(jī)體免疫系統(tǒng)建立之前，犢牛主要從母乳中獲得所需的免疫球蛋白（Godden等，2008）。研究表明，在犢牛出生后如能飲用經(jīng)過(guò)加熱處理的初乳，對(duì)降低其腹瀉發(fā)生率具有一定的作用 （Godden等，2015；Nilusha等，2015）。初乳中所含免疫球蛋白主要為IgA、IgM和IgG。其中IgG為乳中主要的免疫球蛋白，能預(yù)防全身和腸道的感染；IgA對(duì)機(jī)體的黏膜免疫具有顯著作用；IgM則可預(yù)防3日齡以前出生犢牛的敗血癥。研究表明，免疫球蛋白在初乳蛋白質(zhì)中占到23%，而在常乳中僅占3%左右。所以如果犢牛能夠長(zhǎng)期得到足量的初乳，其腹瀉發(fā)生率會(huì)顯著降低。然而在當(dāng)今的規(guī)?；B(yǎng)殖下，犢牛無(wú)法長(zhǎng)期的從初乳中獲得足夠的免疫球蛋白，且其血清中的母源抗體量會(huì)隨著日齡的增加而逐漸的降低，而犢牛哺乳前期是其腹瀉的高發(fā)期。所以為降低犢牛腹瀉發(fā)生率，提高其成活率，人為的提高犢牛血清免疫球蛋白的濃度就顯得極為重要。本研究顯示，飼喂?fàn)倥＝湍概囵B(yǎng)物能夠提高犢牛血清免疫球蛋白的含量，且在犢牛飲用奶中添加酵母培養(yǎng)物效果更加顯著。Kim等（2011）研究表明，飼喂?fàn)倥＝湍概囵B(yǎng)物能改善機(jī)體健康狀況，提高血清免疫球蛋白的濃度。黏膜免疫系統(tǒng)是機(jī)體的第一道免疫防線(xiàn)，其可以將外來(lái)致病菌在侵入機(jī)體組織之前被消滅，從而避免機(jī)體組織受損。而Yuan等（2015）的研究則證實(shí)，添加酵母培養(yǎng)物可以提高機(jī)體IgA含量，增強(qiáng)機(jī)體黏膜免疫應(yīng)答能力。

IL-1β主要為巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，其含量的高低可以作為評(píng)判機(jī)體非特異性免疫的指標(biāo)。TNF-α是由激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種內(nèi)源性細(xì)胞因子，其含量的高低可反映肝損傷的程度。IL-1β的過(guò)度分泌可刺激機(jī)體產(chǎn)生更多的TNF-α，從而引起細(xì)胞損傷。在本試驗(yàn)開(kāi)始后的第21天，各試驗(yàn)組IL-1β的濃度顯著高于Ⅰ組；各處理組血清中TNF-α的濃度差異不顯著，且Ⅱ組血清中TNF-α的濃度為3個(gè)試驗(yàn)組中最低。這說(shuō)明添加酵母培養(yǎng)物提高了犢牛的非特異性免疫，且沒(méi)有對(duì)其造成損傷，并且在牛奶中添加酵母培養(yǎng)物的方案優(yōu)于其他兩種添加方案。這一作用在試驗(yàn)開(kāi)始后的第56天再次得到驗(yàn)證。在試驗(yàn)的第56天，各處理組血清中IL-1β的濃度無(wú)顯著差異，且試驗(yàn)組高于Ⅰ組；而試驗(yàn)組血清中TNF-α的濃度則顯著低于Ⅰ組，且Ⅱ組血清中TNF-α的濃度最低。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在犢牛飲用奶、開(kāi)食料或飲用奶和開(kāi)食料中添加酵母培養(yǎng)物，均對(duì)犢牛生長(zhǎng)性能、腸道健康以及機(jī)體免疫具有促進(jìn)作用；但綜合比較則發(fā)現(xiàn)，在牛奶中添加酵母培養(yǎng)物要優(yōu)于其他兩種添加方式。

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