李真法，陸文昊，楊歡利，蔡嬌嬌，陳輝波

（浙江省臺州醫(yī)院，浙江 臨海317016）

近年來，不孕不育患者的人數(shù)日趨增加，男性不育是亟需解決的生殖難題。有研究證實，常見疾病在不同程度上都會對精子DNA產(chǎn)生損傷[1]，現(xiàn)將最常見的三種對DNA有損傷的疾病 （精索靜脈曲張、乙肝病毒感染、生殖系統(tǒng)感染）的男性不育患者與正常生育能力的健康男性進行比較，探討不育癥患者的不育原因，報道如下。

1 對象與方法

1.1對象 選擇2012年3月～2016年9月在本院生殖中心就診的男性不育患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：婚后正常性生活1年以上未育，無外傷及遺傳性疾病家族史，無性功能障礙病史，體檢未發(fā)現(xiàn)有明顯睪丸、附睪及輸精管異常及其他系統(tǒng)性疾病。共入選356例，分為3組：精索靜脈曲張組120例，年齡（31.1±2.7）歲；乙肝病毒組 101 例，年齡（29.3±2.0）歲；生殖系統(tǒng)感染組 135例，年齡（28.2±3.2）歲，另外選取正常生育能力組 78例，年齡（30.1±2.9）歲。

1.2研究方法

1.2.1標(biāo)本采集及分析 禁欲2～7天后手淫取精液置于干燥無菌的取精杯中，置37℃水浴箱內(nèi)液化30分鐘。使用WLJY-9000全自動精液質(zhì)量分析系統(tǒng)，按照第5版《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》采用計算機輔助精液分析系統(tǒng)行精液質(zhì)量分析，記錄精液體積、精子濃度、精子前向運動率（PR）、精子非前向運動率（NP）及精子不動率（IM）。

1.2.2DNA碎片檢測 試劑盒購自深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司，所有步驟參考試劑說明書進行，步驟如下：（1）取精液待檢樣本，用PBS調(diào)整濃度 5～10×106/mL；（2）把調(diào)整好的精子懸液與瓊脂糖混合并鋪于預(yù)冷的載玻片上，4℃冰箱放置5分鐘；（3）載玻片放至0.6%鹽酸7分鐘，然后放至樣品萃取液25分鐘；（4）把玻片置入蒸餾水5分鐘，然后分別置入70%、90%、100%乙醇中2分鐘，取出晾干；（5）染色：加瑞氏-吉姆薩染液10滴染色3分鐘，然后再加0.8%氯化鈉10滴與瑞氏-吉姆薩染液混勻，染色15分鐘，用純凈水洗滌玻片，封片劑封片。

1.2.3結(jié)果判定 （1）大暈環(huán):暈環(huán)寬度≥精子頭部核較小直徑；（2）中暈環(huán)：暈環(huán)寬度≥精子頭部核較小直徑的 1/3～1；（3）小暈環(huán)：暈環(huán)寬度＜精子頭部核較小直徑1/3；（4）無暈環(huán)和退化：精子觀察不到暈環(huán)，且精子核區(qū)染色較淺。大暈環(huán)和中暈環(huán)表示精子核DNA完整，小暈環(huán)、無暈環(huán)和退化表示精子核DNA損傷。精子DNA碎片化指數(shù) （DFI）=〔（小暈環(huán)精子+無暈環(huán)精子+退化精子）/計數(shù)精子總數(shù)〕×100%，精子 DFI＞10%為異常。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)采用（±s）表示，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1精液常規(guī)檢測 精液體積、精子濃度及非前向運動（NP）的結(jié)果，四組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；精索靜脈曲張組、乙肝病毒組與生殖系統(tǒng)感染組三組之間，精子前向運動率（PR）及不動率（IM）比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），精索靜脈曲張組、乙肝病毒組、生殖系統(tǒng)感染組分別與正常生育能力組比較，PR%及IM%比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。詳見表1。

2.2精子DFI 精索靜脈曲張組、乙肝病毒組分別與生殖系統(tǒng)感染組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05），精索靜脈曲張組與乙肝病毒組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。精索靜脈曲張組、乙肝病毒組和生殖系統(tǒng)感染組分別與正常生育能力組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。詳見表1。

表1 四組精液的常規(guī)參數(shù)和精子DFI比較（±s）

表1 四組精液的常規(guī)參數(shù)和精子DFI比較（±s）

與正常生育能力組比較*P＜0.05；與生殖系統(tǒng)感染組比較△P＜0.05

組別 n 體積（mL） 濃度（×106/mL） PR（%） NP（%） IM（%） 精子DFI(%)精索靜脈曲張組 120 3.12±1.11 68.34±28.98 27.87±11.43* 18.45±6.67 53.68±8.65* 30.23±12.34*△乙肝病毒組 101 3.21±1.32 70.65±29.54 25.76±10.63* 19.33±5.87 54.91±7.74* 29.54±11.45*△生殖系統(tǒng)感染組 135 3.19±1.23 73.98±31.76 28.08±9.42* 21.54±6.66 50.38±8.02* 20.87±9.76*正常生育能力組 78 3.42±1.54 77.34±27.87 45.23±6.92 17.78±5.86 36.99±5.97 13.54±5.64

3 討論

人類精子染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)由DNA雙鏈和魚精蛋白結(jié)合形成，易受到疾病和環(huán)境等因素影響[2]，精子DNA的損傷會導(dǎo)致男性的生育力下降，與男性不育有著直接關(guān)系[3]。本研究中，精索靜脈曲張組和乙肝病毒組比生殖系統(tǒng)感染組的精子DFI均高，不育癥組（精索靜脈曲張組、乙肝病毒組和生殖系統(tǒng)感染組）比有正常生育能力組的精子DFI高，說明精索靜脈曲張（VC）、乙肝病毒感染、生殖系統(tǒng)感染對精子DNA碎片有很大影響，特別是精索靜脈曲張和乙肝病毒感染。

VC是男性常見生殖系統(tǒng)疾病，占男性不育癥成因的40%左右[4]，在三種疾病中所占比例最高，是導(dǎo)致男性不育的主要原因之一。VC是指精索內(nèi)蔓狀靜脈叢的異常伸長、擴張和迂曲。當(dāng)發(fā)生VC時，陰囊溫度增高，從而增多氧自由基等有害物質(zhì)，造成附睪微環(huán)境障礙，影響精子生成[5]。本組中，VC患者精子前向運動率（PR）與正常生育能力組相比較低（P＜0.05），說明VC患者精子活力受到損傷。有研究認為，VC患者的精液可能缺乏抗氧化機制，大量的過氧化物攻擊精子，致使細胞凋亡，從而影響精子活力[6]。VC患者精子DFI較正常生育組高（P＜0.01），說明VC對精子DFI的影響很大。潘連軍等[7]研究也表明，VC中精子質(zhì)膜磷脂酰絲氨酸（PS）外翻、線粒體功能障礙及各種生化指標(biāo)異常是精子DNA損傷的主要因素之一。故VC患者應(yīng)盡早行精索靜脈高位結(jié)扎，以改善精子生存環(huán)境，提升精子質(zhì)量[8]。

生殖系統(tǒng)感染在導(dǎo)致男性不育的諸多因素中約占4%～10%[9]，僅次于精索靜脈曲張。Collodel等[10]顯示，男性生殖系統(tǒng)感染可降低精子活動力，精子DFI指數(shù)升高，導(dǎo)致感染性男性不育。生殖系統(tǒng)感染患者的精液中，白細胞水平＞1.0×106/mL，與其分泌的彈性蛋白酶升高導(dǎo)致精子膜的損傷，從而破壞精子DNA完整性有關(guān)[11]。本文生殖系統(tǒng)感染組精子前向運動率遠低于正常生育能力組（P＜0.05），精子DFI高于正常生育能力組（P＜0.05），說明生殖系統(tǒng)感染對精子活力有明顯的影響。

乙肝病毒不僅具有嗜肝性，還可以感染男性生殖器官。HBV會影響男性精子染色體的結(jié)構(gòu)，破壞其穩(wěn)定性，導(dǎo)致精子DNA基因發(fā)生不可逆的變異，影響精卵結(jié)合[6]。楊旭等[12]研究指出，HBV陽性患者精子濃度、活動精子總數(shù)及正常形態(tài)精子數(shù)均低于陰性者，原因可能是HBV在睪丸上復(fù)制時，DNA與精子染色體整合，引起精子DNA損傷從而影響精子質(zhì)量。本研究中乙肝病毒感染組PR較正常生育能力組低（P＜0.05），乙肝病毒感染組精子DFI較正常生育能力組高（P＜0.05）。 有研究指出[13-14]，男性不育癥中同時伴有HBV感染者的精子DFI顯著高于無HBV感染者，說明感染HBV可能會加重男性不育患者的精子DNA損傷。

綜上所述，精子DNA碎片化指數(shù)能較好地評估精液質(zhì)量和男性生育能力，在男性不育中進行檢測有著重要的意義。

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