王乾興，褚 慧，于明明，張先平

(1.遵義醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，貴州遵義 563003；2.湖南省婁底市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 422907)

男性不育是臨床常見(jiàn)疾病之一。環(huán)境污染、不良生活習(xí)慣等使男性精液質(zhì)量顯著下降[1-2]，已引起了學(xué)界廣泛關(guān)注。環(huán)境錳暴露是引發(fā)男性生殖障礙的一個(gè)重要因素。錳通過(guò)血睪屏障蓄積于睪丸，引起雄性精液質(zhì)量降低和生精細(xì)胞凋亡[3-4]。但慢性錳染毒對(duì)子代雄性的生殖毒理效應(yīng)尚未見(jiàn)報(bào)道。此外，線(xiàn)粒體凋亡途徑引起的凋亡可能是錳毒性的重要原因[5]。線(xiàn)粒體融合/分裂的動(dòng)態(tài)平衡受視神經(jīng)萎縮蛋白1(optic atrophy 1，Opa1)和動(dòng)力相關(guān)蛋白1(dynamin related protein 1，Drp1)控制，其動(dòng)態(tài)失衡將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[6]。錳的雄性生殖毒性是否也通過(guò)這對(duì)基因起作用亦未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究探索母代大鼠長(zhǎng)期低劑量錳染毒對(duì)子代睪丸生精細(xì)胞線(xiàn)粒體功能狀態(tài)和細(xì)胞凋亡的影響，為錳中毒的預(yù)防和治療、環(huán)境錳暴露的安全限量確定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 滿(mǎn)月SPF級(jí)雌性SD大鼠(90～120 g)[第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SCXK(渝)2012-0005]，分為對(duì)照組、低、中、高劑量組，每組8只。每天12 h光照，平均環(huán)境溫度(21±1)℃，自由進(jìn)食飲水。實(shí)驗(yàn)獲得遵義醫(yī)學(xué)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑 MnCl2·4H2O(分析純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司)；TUNEL試劑盒(美國(guó)Roche公司)；RNAiso Plus(日本TaKaRa公司)；qPCR反應(yīng)試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；Drp1、半胱氨酸蛋白酶9(Caspase9)兔多抗(美國(guó)Proteintech公司)；Opa1兔單抗(英國(guó)Abcam公司)；qPCR擴(kuò)增引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成：Opa1 (CTC GCT ATC ACT GCC AAC AC，CTT CTT CTC GCC GTC TTC AG)；Drp1 (AAC AGG CAA CTG GAG AGG AA，GCA ACT GGA ACT GGC ACA T)；Caspase9 (CCA CTG CCT CAT CAT CAA CA，TCG TTC TTC ACC TCC ACC AT)；GAPDH (GAC ATG CCG CCT GGA GAA AC，AGC CCA GGA TGC CCT TTA GT)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型及取材 雌性SD大鼠飼養(yǎng)1周，注射生理鹽水或2、4、8 mg/kg氯化錳8周，與正常雄性大鼠交配，檢測(cè)到陰栓后單獨(dú)飼養(yǎng)。雌鼠在妊娠期和哺乳期繼續(xù)染毒，總?cè)径緯r(shí)間14周。給藥途徑為腹腔注射，1次/天，5天/周。每3天測(cè)大鼠體質(zhì)量以調(diào)整MnCl2用量。每組8只12周齡子代大鼠斷頭處死后分離雙側(cè)睪丸，左側(cè)用于qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)；右側(cè)用5%戊二醛或4%多聚甲醛固定，用于透射電鏡觀察、蘇木精-伊紅(HE)染色、末端標(biāo)記法(TUNEL)和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2透射電鏡觀察生精細(xì)胞線(xiàn)粒體形態(tài) 將睪丸剪成 1 mm3組織塊，5%戊二醛固定、脫水、樹(shù)脂包埋,超薄切片、醋酸雙氧鈾染色，透射電鏡觀察。

1.2.3TUNLE法檢測(cè)生精細(xì)胞凋亡 睪丸冠狀切片常規(guī)脫蠟水化。微波修復(fù)抗原。0.3%的 H2O2-甲醇封閉10 min。加反應(yīng)液37 ℃避光溫育1 h，加轉(zhuǎn)化劑POD 37 ℃反應(yīng)30 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡檢。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照(只加標(biāo)記反應(yīng)液)和陽(yáng)性對(duì)照(10 μg/mL 的DNAase Ⅰ預(yù)處理)。每張切片選擇10個(gè)生精小管，計(jì)數(shù)凋亡信號(hào)陽(yáng)性的生精細(xì)胞數(shù)占總生精細(xì)胞數(shù)的比例，即為凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)。

1.2.3qPCR檢測(cè)Opa1、Drp1、Caspase9 mRNA表達(dá) RNAiso Plus提取總RNA，經(jīng)純度鑒定和濃度測(cè)定后取2 μg總RNA，兩步法RT反應(yīng)合成cDNA(42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 s、4 ℃ 10 min)。按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qPCR(20 μL體系：94 ℃ 30 s、94 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán))。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，以2-△△CT為目的基因相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)標(biāo)本設(shè)置3管重復(fù)，取3次的平均值計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4免疫組織化學(xué)檢測(cè)Opa1、Drp1和Caspase9蛋白表達(dá) 石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，3% H2O2阻斷，微波修復(fù)抗原，山羊血清封閉。滴加一抗Drp1(1∶50)、Caspase9(1∶50)和Opa1(1∶500)，4 ℃過(guò)夜。二抗37 ℃反應(yīng)30 min。DAB顯色，復(fù)染、脫水、封片，光鏡觀察。以磷酸緩沖鹽溶液(PBS)代替一抗為陰性對(duì)照。

1.2.5Western blot檢測(cè)Opa1、Drp1和Caspase9蛋白表達(dá) 睪丸100 mg加500 μL RIPA 裂解液，同時(shí)加5 μL PMSF和蛋白磷酸酶抑制劑，4 ℃勻漿，12 000 r/min離心15 min，小心吸取上清，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。取40 μg蛋白上樣，10%分離膠120 V電泳，100 mA轉(zhuǎn)印，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗(Opa1為1∶1 000、Drp1為1∶500、Caspase9為1∶1 000、GAPDH為1∶4 000)4 ℃過(guò)夜。二抗37 ℃孵育1 h，ECL發(fā)光、顯影、定影。將膠片掃描，用Image Pro Plus軟件分析目的條帶光密度值，以目的條帶/GAPDH為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1長(zhǎng)期低劑量錳染毒對(duì)子代大鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)的影響 對(duì)照組睪丸曲細(xì)精管管腔大小基本一致、各級(jí)生精細(xì)胞有序排列，管腔內(nèi)可見(jiàn)大量精子細(xì)胞和成熟精子。各錳染毒組睪丸生精小管呈現(xiàn)不同程度的形態(tài)學(xué)改變。隨著錳染毒劑量的增加，生精細(xì)胞層數(shù)逐漸減少，生精細(xì)胞排列紊亂、數(shù)量減少或缺如，管腔內(nèi)成熟的精子數(shù)目明顯減少，見(jiàn)圖1。

A:對(duì)照組；B:低劑量組；C:中劑量組；D：高劑量組

圖1子代大鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)的改變(HE ×400)

A:線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)完整，連接成網(wǎng)；B:線(xiàn)粒體分離成單個(gè)；C.線(xiàn)粒體腫脹,嵴消失(箭頭所示)

圖2子代大鼠睪丸生精細(xì)胞線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)形態(tài)的改變(TEM×1400)

2.2長(zhǎng)期低劑量錳染毒對(duì)子代大鼠生精細(xì)胞線(xiàn)粒體形態(tài)的影響 對(duì)照組生精細(xì)胞線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)完整，相互連接成網(wǎng)；低、中劑量組生精細(xì)胞線(xiàn)粒體則分離成單個(gè)；高劑量組線(xiàn)粒體表現(xiàn)為腫脹、嵴消失，見(jiàn)圖2。

2.3長(zhǎng)期低劑量錳染毒對(duì)子代大鼠生精細(xì)胞Opa1和Drp1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響 qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，低劑量組Opa1 mRNA表達(dá)量無(wú)明顯變化，但中、高劑量組顯著降低，且隨錳染毒劑量的增加逐漸遞減(P<0.05，P<0.01)；Drp1 mRNA表達(dá)情況則剛好與Opa1相反，見(jiàn)表1。

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Opa1表達(dá)于各級(jí)生精細(xì)胞和精子細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。其染色強(qiáng)度隨錳染毒劑量的增加而減弱；Drp1主要表達(dá)于各級(jí)生精細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。低劑量組和對(duì)照組染色強(qiáng)度無(wú)明顯差異，中、高劑量組明顯升高，見(jiàn)圖3。

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，低劑量組Opa1蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異，而中、高劑量組均顯著降低，且隨錳染毒劑量的增加而降低(P<0.05，P<0.01)。與對(duì)照組相比，各錳染毒組Drp1蛋白表達(dá)均顯著增加，且隨錳染毒劑量的增加而遞增(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表1 子代大鼠睪丸組織Opa1、Drp1和Caspase 9 mRNA相對(duì)表達(dá)量

a：P<0.01，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與低劑量組比較；c：P<0.01，與低劑量組比較；d：P<0.05，與中劑量組比較；e：P<0.01，與中劑量組比較

表2 子代大鼠睪丸組織Opa1、Drp1、Caspase 9蛋白相對(duì)表達(dá)量和

a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.01，與對(duì)照組比較；c：P<0.05，與低劑量組比較；d：P<0.01，與低劑量組比較；e：P<0.05，與中劑量組比較；f：P<0.05，與中劑量組比較

2.4長(zhǎng)期低劑量錳染毒對(duì)子代大鼠生精細(xì)胞凋亡和Caspase9表達(dá)的影響 TUNEL法原位檢測(cè)大鼠生精細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，各組大鼠均可見(jiàn)生精細(xì)胞凋亡，其細(xì)胞核呈棕黃色，主要見(jiàn)于精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和精子細(xì)胞。各劑量組生精細(xì)胞AI均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，且隨錳染毒劑量的增加而增加(P<0.01)。qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各錳染毒組Caspase 9 mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高，且隨錳染毒劑量的增加逐漸增加(P<0.05)。這一規(guī)律在免疫組織化學(xué)和Western blot結(jié)果中也有相同的體現(xiàn)，見(jiàn)表2、圖3～5。

圖3 子代大鼠生精細(xì)胞Opa1、Drp1和Caspase9蛋白表達(dá)定位(SP×400)

圖4 子代大鼠睪丸組織內(nèi)蛋白定量(Western blot)

圖5 子代大鼠生精細(xì)胞的凋亡(TUNEL×400)

3 討 論

毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)所采用的錳染毒途徑有經(jīng)呼吸道、消化道、循環(huán)系統(tǒng)3條[4，7-9]。呼吸道染毒可以較真實(shí)地反映錳塵導(dǎo)致的毒性，但操作比較繁瑣；消化道染毒由于動(dòng)物活動(dòng)度下降而可能影響到最終錳攝入量。以往采用循環(huán)系統(tǒng)染毒的劑量大都在7.5 mg/kg以上，遠(yuǎn)大于環(huán)境錳暴露水平，對(duì)職業(yè)防護(hù)指導(dǎo)意義有限。因此本實(shí)驗(yàn)采取較低劑量(2、4、8 mg/kg)氯化錳進(jìn)行腹腔注射，以評(píng)價(jià)其對(duì)子代雄性的生殖毒性。

線(xiàn)粒體的融合/分裂的動(dòng)態(tài)平衡反映了線(xiàn)粒體的功能狀態(tài)。研究證實(shí)線(xiàn)粒體分裂是細(xì)胞凋亡的最早階段，凋亡過(guò)程中存在線(xiàn)粒體從管網(wǎng)狀向點(diǎn)狀的轉(zhuǎn)換[10-11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組睪丸生精細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)完整，相互連接成網(wǎng)；錳染毒后則分離成單個(gè)甚至表現(xiàn)出腫脹、嵴消失。結(jié)合HE染色結(jié)果，隨著錳染毒劑量的增加，生精細(xì)胞層數(shù)逐漸減少，各級(jí)生精細(xì)胞排列紊亂、數(shù)量減少或缺如，管腔內(nèi)成熟的精子數(shù)目明顯減少，提示長(zhǎng)期低劑量錳染毒后子代大鼠生精細(xì)胞線(xiàn)粒體功能降低，降低其能量供應(yīng)而影響生精功能。

線(xiàn)粒體的融合/分裂的動(dòng)態(tài)平衡主要受到Opa1/Drp1控制。Opa1是由核基因編碼的動(dòng)力相關(guān)蛋白，主要誘導(dǎo)線(xiàn)粒體膜融合和控制凋亡過(guò)程中嵴的重塑。Opa1低表達(dá)凋亡敏感性增加，過(guò)表達(dá)則抑制凋亡[12-13]。Drp1是動(dòng)力蛋白GTP酶超家族成員，在線(xiàn)粒體分裂中起關(guān)鍵作用[14]。Drp1磷酸化可引起細(xì)胞色素C的釋放、促凋亡蛋白釋放，激活Caspase9，引起細(xì)胞凋亡[15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期低劑量錳染毒后，子代大鼠生精細(xì)胞中Opa1 mRNA和蛋白表達(dá)量在中、高劑量組顯著降低，且隨錳染毒劑量的增加逐漸遞減；Drp1的表達(dá)趨勢(shì)則與之相反。例外的是低劑量組Drp1的Western blot結(jié)果也高于對(duì)照組，可能和樣本量較小有關(guān)。所以，當(dāng)錳染毒劑量達(dá)4 mg/kg以上時(shí)，Opa1表達(dá)下降同時(shí)Drp1表達(dá)上升，提示子代大鼠睪丸生精細(xì)胞線(xiàn)粒體趨向分裂，導(dǎo)致生精細(xì)胞能量供應(yīng)不足，誘導(dǎo)其凋亡，這與大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的研究結(jié)果相似[16-17]。

錳誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡主要是通過(guò)線(xiàn)粒體途徑進(jìn)行，即通過(guò)降低Opa1、增加Drp1的表達(dá)，引起線(xiàn)粒體膜電位的改變、細(xì)胞色素C的釋放，細(xì)胞色素C與凋亡酶激活因子(Apaf1) 結(jié)合，募集并激活 Caspase9，啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡[16-19]。本研究結(jié)果顯示，Caspase 9 mRNA和蛋白在各錳染毒組均升高，且隨錳染毒劑量的增加逐漸增加，且生精細(xì)胞 AI 也隨錳染毒劑量的增加而上升。提示長(zhǎng)期低劑量錳染毒可誘導(dǎo)子代大鼠睪丸生精細(xì)胞Caspase級(jí)聯(lián)信號(hào)被啟動(dòng)，引起生精細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，長(zhǎng)期低劑量錳染毒可抑制Opa1和促進(jìn)Drp1表達(dá)，使線(xiàn)粒體融合/分裂失衡，啟動(dòng)Caspase9信號(hào)，最終導(dǎo)致子代大鼠生精細(xì)胞凋亡。

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