張曉娟，段夢(mèng)園，李 娟，郭 磊，鞠 瑞，朱 蕾，葉菜英

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 藥理系， 北京 100005)

唾液腺是人體重要的腺體之一，包括腮腺、頜下腺和舌下腺3對(duì)大唾液腺以及散在分布口腔各壁的眾多小唾液腺，其主要功能是分泌唾液，參與咀嚼、吞咽、消化、發(fā)音和言語等[1]。唾液腺功能減退可導(dǎo)致相關(guān)疾病，典型代表是干燥綜合征(Sj?gren’s syndrome, SS)，該病由于唾液腺受累導(dǎo)致口腔干燥[2]。鑒于唾液腺是SS中的重要受損靶器官，建立唾液腺細(xì)胞體外培養(yǎng)方法對(duì)于研究其功能，進(jìn)一步探討SS的發(fā)病機(jī)制以及評(píng)價(jià)SS的治療藥物具有重要意義。

本研究采用膠原酶消化法培養(yǎng)小鼠頜下腺上皮細(xì)胞，探究頜下腺上皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)的最佳方法和條件，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與材料

SPF級(jí)C57BL/6小鼠，4周齡左右，體質(zhì)量17～22 g，雌雄不拘[北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2014- 0004]；IV型膠原酶(Sigma公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基、F- 12培養(yǎng)基(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)；胎牛血清(Gibco公司)；表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)(R&D公司)；細(xì)胞角蛋白8(cytokeratin 8, CK- 8)抗體、波形蛋白(vimentin)抗體和山羊抗兔IgG/Alexa Fluor 488標(biāo)記(Abcam公司)；錐蟲藍(lán)染液(碧云天生物技術(shù)有限公司)；CCK- 8試劑盒(日本東仁化學(xué)科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 頜下腺上皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng)[3- 6]：斷頸處死小鼠，75%乙醇浸泡消毒后，超凈臺(tái)內(nèi)無菌摘取雙側(cè)頜下腺，冰PBS漂洗，去除附帶的脂肪、包膜等，剪碎，加入Ⅳ型膠原酶(0.25 g/L，PBS配置)，37 ℃消化3 h，期間每隔30 min輕輕振蕩以促進(jìn)消化。消化后的液體經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾后，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加紅細(xì)胞裂解液5 mL，輕輕吹打充分裂解紅細(xì)胞后，PBS清洗，用少量培養(yǎng)基(F- 12∶DMEM=3∶1，2.5% FBS，10 μg/L EGF，2 mmol/L L-谷氨酰胺，100 U/mL青霉素，100 mg/L鏈霉素)重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度后接種于大培養(yǎng)皿中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。每隔2～3 d換1次培養(yǎng)基，細(xì)胞鋪滿單層后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察：從培養(yǎng)的第1天開始，每隔1 d光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，記錄細(xì)胞增殖狀態(tài)并拍照。

1.2.3 頜下腺細(xì)胞的純化[7]：最初分離的細(xì)胞中混有成纖維細(xì)胞，根據(jù)成纖維細(xì)胞與目的細(xì)胞貼壁能力和時(shí)間的差別，采用差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞的貼壁能力強(qiáng)，在接種30～60 min左右基本完全貼壁，目的細(xì)胞約24 h貼壁。接種細(xì)胞約1 h后，將含有目的細(xì)胞的上清收集繼續(xù)培養(yǎng)，反復(fù)多次即得到純度較高的目的細(xì)胞。

1.2.4 細(xì)胞存活率的測(cè)定：接種前采用錐蟲藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞存活率。取適量細(xì)胞懸液與錐蟲藍(lán)染液混勻，滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板。3 min內(nèi)，在顯微鏡下計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞。未著色的為活細(xì)胞，呈藍(lán)色的為死細(xì)胞。計(jì)算公式：存活率(%)=(活細(xì)胞數(shù)/300)×100%。

1.2.5 免疫熒光染色鑒定細(xì)胞：取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，爬片后4%多聚甲醛固定20 min，0.3% Triton X- 100通透，牛血清白蛋白封閉后，一抗(CK- 8 抗體或vimentin抗體)4 ℃孵育過夜。PBS清洗后，山羊抗兔IgG/ Alexa Fluor 488標(biāo)記的二抗37 ℃孵育1 h，避光操作，最后DAPI染核，封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 細(xì)胞增殖曲線檢測(cè)[7- 8]：細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106個(gè)/L，接種至10塊96孔板，每孔200 μL細(xì)胞懸液，接種24 h后每天用CCK- 8法檢測(cè)，具體為：每孔加入20 μL CCK- 8試劑，孵育4 h后450 nm處測(cè)定吸光度值。以時(shí)間為橫軸，吸光度值為縱軸，繪制細(xì)胞增殖曲線。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞存活率

接種前用錐蟲藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞存活率，大約為97.5%。

2.2 頜下腺細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征

體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞24 h左右貼壁，此時(shí)細(xì)胞為圓形，之后細(xì)胞慢慢伸展，呈現(xiàn)多邊形。第2天細(xì)胞開始形成集落，增殖的細(xì)胞呈形態(tài)一致的立方體，第7～8天見部分細(xì)胞表現(xiàn)為鋪路石樣排列，未見導(dǎo)管或腺泡樣結(jié)構(gòu)(圖1)。傳代細(xì)胞與原代形態(tài)基本一致，接種后7～9 d可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，一般能傳3代，至第4代細(xì)胞活性變差，死亡的細(xì)胞變多，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中漂浮大量細(xì)胞碎片，且細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樾切?，表面出現(xiàn)突起，已不適合做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

圖1 原代培養(yǎng)的頜下腺細(xì)胞Fig 1 Primary culture of the submandibular gland cells (×100)

2.3 免疫熒光染色結(jié)果

體外培養(yǎng)的頜下腺細(xì)胞CK 8表達(dá)陽性，胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色熒光(圖2A)，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，陽性率約為85%；vimentin表達(dá)為陰性(圖2B)，提示培養(yǎng)的細(xì)胞為頜下腺上皮細(xì)胞。

A.culture cells were positively stained by CK 8 antibody; B.culture cells were negatively stained by vimentin antibody圖2 免疫熒光染色法鑒定頜下腺細(xì)胞Fig 2 Identification of the submandibular gland cells by immunofluorescence staining (×200)

2.4 細(xì)胞增殖特點(diǎn)

根據(jù)吸光度值繪制細(xì)胞增殖曲線。細(xì)胞于第1～2天處于滯留期，完成貼壁并有部分增殖，第3天開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，細(xì)胞增殖迅速，第7天達(dá)到頂峰，隨后細(xì)胞增殖趨勢(shì)緩慢下降(圖3)。

圖3 頜下腺上皮細(xì)胞的增殖曲線Fig 3 Proliferation curve of the submandibular gland

3 討論

SS是一種常見的慢性炎癥性的自身免疫性疾病，發(fā)病率逐年增高[2]。唾液腺破壞是其重要表現(xiàn)，80%患者有口腔干燥癥，唾液分泌明顯減少，嚴(yán)重者影響說話，甚至出現(xiàn)“猖獗齒”[9]。目前SS的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，現(xiàn)有治療方法非常有限，且收效甚微。因此建立體外細(xì)胞培養(yǎng)模型，有助于為SS以及其他唾液腺相關(guān)疾病的研究和藥物評(píng)價(jià)提供體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

唾液腺細(xì)胞是一種終末分化細(xì)胞，培養(yǎng)相對(duì)困難，一直是眾多學(xué)者研究的難題。目前唾液腺細(xì)胞培養(yǎng)大多取材于大鼠腮腺，或者在培養(yǎng)液中添加糖皮質(zhì)激素、胰島素等以促進(jìn)細(xì)胞增殖[7, 10- 11]。然而，唾液的70%由頜下腺分泌，且有研究報(bào)道SS患者的頜下腺功能損害較腮腺常見，SS患者早期頜下腺唾液流量減少亦比腮腺更顯著[12]。而且，SS作為一種自身免疫性疾病，培養(yǎng)液中添加糖皮質(zhì)激素等藥物不利于細(xì)胞保持原有的功能，干擾對(duì)SS發(fā)病機(jī)制的探討以及治療藥物的評(píng)價(jià)。

目前已知頜下腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法包括組織塊法和膠原酶消化法，與前者相比，膠原酶消化法能縮短獲取大量細(xì)胞的時(shí)間[11]。本研究采用作用溫和的Ⅳ型膠原酶消化細(xì)胞以減輕對(duì)細(xì)胞的損傷，錐蟲藍(lán)染色法顯示細(xì)胞存活率達(dá)97.5%。隨后采用差速貼壁法除去混雜的成纖維細(xì)胞，獲得較為純化的目的細(xì)胞。頜下腺細(xì)胞是一種需復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)的、在一般合成培養(yǎng)基中不易增殖的細(xì)胞，我們用含10 μg/L EGF的F- 12/DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)獲得成功，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)，且頜下腺是產(chǎn)生EGF的主要器官，體外培養(yǎng)的頜下腺上皮細(xì)胞本身可合成并分泌EGF[13]，因此添加低濃度的EGF有利于細(xì)胞增殖并保持功能，且不會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。經(jīng)過上述方法得到的原代和傳代培養(yǎng)細(xì)胞，形態(tài)呈上皮樣，鏡下觀察為多邊形，鋪路石樣排列。根據(jù)增殖曲線，細(xì)胞增殖能力良好，一般能傳3代，到第4代時(shí)，增殖能力明顯降低。在細(xì)胞鑒定方面，CK- 8表達(dá)陽性，而vimentin表達(dá)陰性，符合唾液腺細(xì)胞的表型特征，證實(shí)了所培養(yǎng)的細(xì)胞為上皮來源的可靠性。

綜上所述，本研究采用膠原酶消化法獲得了增殖良好的小鼠頜下腺上皮細(xì)胞，方法簡(jiǎn)便易行，這為進(jìn)一步研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

[1] Atkinson JC, Grisius M, Massey W. Salivary hypofunc-tion and xerostomia: diagnosis and treatment [J]. Dent Clin North Am, 2005, 49: 309- 326.

[2] Shashikala K, Subash BV, Sandhya V. Salivary gland disorders: A comprehensive review [J]. World J Stomatol, 2015, 4: 56- 71.

[3] Park YJ, Koh J, Gauna AE,etal. Identification of regulatory factors for mesenchymal stem cell-derived salivary epithelial cells in a co-culture system [J]. PLoS One, 2014, 9: e112158, doi: 10.1371/journal.pone.0112158.

[4] Sisto M, Barca A, Lofrumento DD,etal. Downstream activation of NF-kappaB in the EDA-A1/EDAR signalling in Sj?gren’s syndrome and its regulation by the ubiquitin-editing enzyme A20 [J]. Clin Exp Immunol, 2016, 184: 183- 196.

[5] Sisto M, Lorusso L, Lisi S. TLR2 signals via NF-kappaB to drive IL- 15 production in salivary gland epithelial cells derived from patients with primary Sj?gren’s syndrome [J]. Clin Exp Med, 2017, 17: 341- 350.

[6] Dimitriou ID, Kapsogeorgou EK, Abu-Helu RF,etal. Establishment of a convenient system for the long-term culture and study of non-neoplastic human salivary gland epithelial cells [J]. Eur J Oral Sci, 2002, 110: 21- 30.

[7] 黃巍巍, 譚學(xué)新, 李波, 等. 組織塊法培養(yǎng)大鼠頜下腺細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究 [J]. 中國醫(yī)科大學(xué)報(bào), 2010, 39: 194- 196.

[8] 刑紅艷, 劉彥普, 劉斌, 等. 體外培養(yǎng)小鼠下頜下腺細(xì)胞生長(zhǎng)特性的實(shí)驗(yàn)研究 [J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2013, 13: 5409- 5412.

[9] Pilar BZ, Chiara B, Hendrika B,etal. Sj?gren’s Syndrome [J]. Nat Rev Did Primers, 2016, 2: 1- 20.

[10] Oliver C. Isolation and maintenance of differentiated exocrine gland acinar cells in vitro [J]. In Vitro, 1980, 16: 297- 305.

[11] 王蕾, 王雪紅, 張華炎, 等. 組織塊法和酶消化法培養(yǎng)大鼠頜下腺細(xì)胞的比較研究 [J]. 大連大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 35: 103- 106.

[12] Pijpe J, Kalk WW, Bootsma H,etal. Progression of salivary gland dysfunction in patients with Sjogren’s syndrome [J]. Ann Rheum Dis, 2007, 66: 107- 112.

[13] Barka T. Biologically active polypeptides in submandibular gland [J]. J Histochem Cytochem, 1980, 28: 836- 859.