江 倫，白 麗

(大理大學 基礎醫(yī)學院 云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室， 云南 大理 671000)

腫瘤干細胞(tumor stem cells，TSCs) 又叫癌干細胞(cancer stem cells，CSCs)和癌起始細胞(cancer initiating cells，CICs)等，是血液腫瘤和實體瘤中分離的一小群特殊細胞，具有高致癌作用，能長期自我更新，有分化成多種細胞譜系的能力，廣泛參與腫瘤的發(fā)生﹑發(fā)展﹑轉移﹑復發(fā)和耐藥等過程[1]。一個TSCs通過非對稱分裂形成兩個細胞，一個細胞保持母代干細胞的能力，另一個細胞則定向分化形成非腫瘤干細胞(non-stem cancer cells，NSCCs)，成為腫瘤塊或者補充死亡的腫瘤細胞[1- 2]，故認為TSCs是腫瘤的起始細胞或者種子細胞并且能維持腫瘤生存。因此，治愈腫瘤關鍵可能在于根除TSCs。克隆進化模型理論[3]認為，腫瘤的發(fā)生是由于基因連續(xù)突變積累的結果。基于此理論衍生出來的化療、放療以及手術療法可能存在先天缺陷，雖能殺死大部分腫瘤細胞，但對TSCs無反應，殘余的TSCs使腫瘤復發(fā)和轉移。因此，眾多學者認為利用人體免疫反應根除TSCs的免疫治療有廣闊的前景。

1 靶向抗原的療法

TSCs和腫瘤微環(huán)境存在很多關鍵分子，靶向抗原治療的關鍵分子主要包括TSCs腫瘤表面抗原﹑TSCs傳導信號通路檢查點和形成腫瘤微環(huán)境的關鍵點。特異性地針對這些標志物的免疫細胞或者細胞因子，能直接或間接殺傷TSCs。

1.1 靶向TSCs表面抗原

TSCs抗原是指只表達或高表達于TSCs表面的新抗原。CD44受體是位于TSCs表面的特異性腫瘤抗原，所有CD44受體或者亞型的配體都是透明質酸(hyaluronan，HA)。HA與CD44受體結合產(chǎn)生的相互作用包括：1)激活/調節(jié)膜上信號域，如轉化生長因子β1型受體(transforming growth factor β1 receptor，GFβR1)和酪氨酸酶受體(ErbB2和EGFR)，刺激細胞增殖。2)介導非受體激酶，如Src家族或Ras家族的三磷酸鳥苷酶，通過中介最終激活蛋白激酶途徑MAPK和PI3激酶，這些通路與細胞增殖、存活﹑遷移﹑入侵和抗藥有密切關系。3)刺激轉運代謝蛋白，使TSCs產(chǎn)生抗藥性。4)誘導細胞骨架改變，從而促進細胞移動和侵襲[4]?？傊?，CD44受體特異性抗原在TSCs中扮演重要角色。利用單克隆抗體MEN- 85結合CD44的透明質酸鹽結合域(hyaluronate-binding domain， HABD)的C端引起構象重排，將信號傳入HA結合槽，導致CD44受體從TSCs表面脫落，從而阻斷HA-CD44的信號通路[5]。在此機制上，發(fā)現(xiàn)體外靶向CD44受體抗原治療人胰腺癌的TSCs[6]，能殺死TSCs和腫瘤細胞。此類特異性抗原可表達于多種TSCs的表面。一個TSCs也可以表達多種特異性抗原。如CD44受體還可以表達于肺癌以及乳腺癌的TSCs[4]，乳腺癌的TSCs不僅表達CD44受體還表達ALDH分子[3]。目前，TSCs上發(fā)現(xiàn)不少特異性抗原，但此類抗原并不在所有類型腫瘤的TSCs表面都表達。將來的研究方向可能是找到高效通用的特異性抗原或者靶向多種特異性抗原的多效價抗體來治療所有類型的腫瘤。

1.2 靶向信號通路抗原-檢查點

信號通路在TSCs的生存﹑更新和轉移中扮演重要角色，各條信號通路上均有關鍵蛋白被視為檢查點。能增強基因轉錄因子的表達，提高腫瘤瘤塊形成和TSCs發(fā)展腫瘤的能力，增加TSCs表面特異性抗原的表達，抑制細胞凋亡等。Notch信號通路在腫瘤微環(huán)境中異常活躍，運用抑制劑靶向阻斷檢查點的信號傳遞，能減少TSCs細胞數(shù)量和抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展[7]。Wnt信號通路主要在干細胞以及分化過程中發(fā)揮作用，阻滯Wnt信號能降低TSCs表面分子CD44和乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)表達和抑制腫瘤自我更新和轉移。刺猬信號通路(Hh)可維持TSCs生存；TGF-β信號通路抑制適應性免疫反應和促進TSCs自我更新和抑制分化?？蓪z查點視為抗原，利用特異性單克隆抗體靶向阻滯檢查點或靶向阻滯多條信號通路的各個檢查點，比如Notch途徑中成束蛋白和Wnt途徑中的β連環(huán)蛋白聯(lián)合阻滯，可能比藥物單獨阻滯精準高效。

1.3 靶向腫瘤微環(huán)境中的抗原

腫瘤微環(huán)境成分與TSCs有復雜的相互作用，前者包括間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)﹑腫瘤相關的巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAMs)﹑調節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)﹑癌相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)﹑細胞因子和生長因子網(wǎng)絡等。這些成分在支持和保持TSCs生存發(fā)揮重要作用。例如Treg細胞抑制免疫應答，CAFs能合成肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等多種多樣的生物因子，促進腫瘤細胞的生長和浸潤，特別是微環(huán)境內(nèi)的腫瘤細胞也能分泌的因子，能刺激TSCs自我更新，誘導血管生存，并招募免疫細胞和其他基質細胞分泌額外的因子促進腫瘤侵襲和遷移[8]。針對這些成分，運用單克隆抗體靶向清除，打破TSCs腫瘤微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，導致TSCs凋亡，可能是一個研究方向。

2 DC疫苗靶向TSCs中的應用

樹突狀細胞疫苗已成為癌疫苗治療TSCs的熱點。樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)是已知的最強大的抗原呈遞細胞，未成熟的DCs細胞刺激T細胞能力弱，接觸抗原后變成成熟的DCs，成熟的DCs能高效刺激T細胞產(chǎn)生免疫應答。在腫瘤TSCs的微環(huán)境中，成熟的DCs少，抗原呈遞能力弱，將大量成熟DCs與TSCs溶解物制成疫苗用于治療小鼠惡性黑色素瘤的實驗中，證實大量成熟的DCs能有效的把抗原呈遞給細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，產(chǎn)生適應免疫反應，殺死TSCs[9]；同時抑制血管相關因子VCGF、VCAM和ICAM- 1的生成[10]。DC疫苗是通過成熟DC細胞與產(chǎn)物如轉染的抗原，純化肽，腫瘤細胞，腫瘤細胞溶解物等共同包被，增加內(nèi)生抗原，從而產(chǎn)生高效的免疫反應。通過DC疫苗包被不同產(chǎn)物構建6組實驗，發(fā)現(xiàn)基于樹突狀細胞和細胞因子誘導的殺傷細胞組(DC-CIK)效果比其他組(包括基于TSCs溶解產(chǎn)物的DC疫苗)更高效[11]?；?003—2014年的臨床病例分析驗證了DC-CIK組的療效[12]。DC疫苗不能直接殺傷TSCs，但作為免疫殺傷細胞識別TSCs中重要的橋梁，是激活殺傷細胞的關鍵。

3 過繼免疫療法在靶向TSCs治療中的應用

3.1 T細胞過繼療法

T細胞是適應性免疫的主要效應細胞，免疫應答中能形成記憶T細胞，從而得到長久免疫力而被重視。CTL和輔助性T細胞(helper T cell，Th)是抗腫瘤的重要細胞。在體外實驗，活化的T細胞通過NKG2D/DNAM1系統(tǒng)激活T細胞溶解腫瘤細胞，而且確定能殺死TSCs。T細胞通過細胞與細胞接觸方式被活化，T細胞表面的NKG2D分子是識別抗原的重要受體，未激活狀態(tài)的T細胞NKG2D分子表達低，識別能力弱。同時TSCs表面過度表達腱生蛋白C(tenascin-C)，此蛋白能與T細胞的整合素結合，阻斷T細胞受體與配體結合時產(chǎn)生的信號傳入細胞內(nèi)部，從而阻斷識別TSCs，最終抑制T細胞活化和增殖。TSCs高表達TGF-β和PD- 1配體以及微環(huán)境中Treg細胞等也發(fā)揮了抑制T細胞的活化增殖的功能。用IL- 2活化T細胞，將活化的T細胞在體外或過繼小鼠體內(nèi)都能通過抗特異性抗原EpCAM，從而靶向殺死TSCs[13]。

3.2 NK細胞過繼療法

自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)是1980中期發(fā)現(xiàn)的免疫細胞，人NK細胞以表面有CD56 和CD16(FcγRIII)分子為特征，具有抗腫瘤﹑抗微生物感染和參與排斥反應的能力。近年研究表明，NK細胞可能是適合殺傷TSCs的細胞。原因如下：1)抗腫瘤免疫中，NK細胞無需像T細胞一樣接受處理的抗原呈遞，而是通過表面活化性受體如NKG2D/NKG2C等對“自身”與“非己”進行快速識別，并直接殺傷腫瘤細胞和靶細胞；也可通過ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)作用或者(和)分泌細胞因子協(xié)助殺傷腫瘤細胞[14- 15]，在免疫監(jiān)視中以效應細胞發(fā)揮重要作用。2)NK細胞能表達MHC1類分子協(xié)助識別靶細胞。3)NK細胞優(yōu)先靶向殺傷特異性抗原過表達的TSCs，同時殺傷NSCCs，從而完全清除腫瘤[16]。4)TSCs低表達MHCⅠ類分子和高表達配體分子，配體分子能被NK細胞識別，此特性能被NK細胞很好的識別并殺死TSCs。目前，NK細胞過繼免疫療法已經(jīng)在惡性血液腫瘤方面得到驗證，但在實體腫瘤治療效果不佳，主要是因為機體無能力提供足夠的活化NK[14，17]。Ames[14]則通過體外培養(yǎng)NK細胞并活化，然后將NK細胞過繼給小鼠，觀察到活化的NK細胞能優(yōu)先殺傷TSCs。由此可以推斷，如能活化NK細胞并增加足夠的數(shù)量，加上NK細胞先天優(yōu)勢，則抗腫瘤能事半功倍。

3.3 CIK過繼療法

早期，細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cell，CIK)作為輔助治療肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，能減少腫瘤復發(fā)率，延長無病生存和總生存率[18]，展示免疫治療前景。進一步研究發(fā)現(xiàn)，CIK細胞共表達CD3和CD56，具有自然殺傷淋巴細胞的細胞毒性的特點[19- 20]。故將CIK細胞在體外激活增殖后過繼給患者，以提高患者抗腫瘤的免疫力。CIK細胞過繼療法早期用于抗自體黑色素瘤的TSCs；繼而，有CIK細胞能殺死自體轉移性骨肉瘤和軟組織肉瘤等其他實體腫瘤TSCs的報道[21- 22]。CIK細胞能高效殺死TSCs和殺死NSCCs，主要通過表面受體NKG2D/NKp30和DNAM- 1直接識別靶細胞的機制和分泌因子協(xié)助抗腫瘤細胞。相比T細胞識別TSCs受主要組織相容性復合體(major histocmpatibility complex，MHC)限制而言，此機制使CIK細胞具有更強效殺死TSCs和非TSCs的腫瘤細胞的能力[23]。

4 分化療法在靶向TSCs療法中的應用

正常細胞一般具有密度抑制依賴的特性，即細胞分化增殖一定數(shù)量后會反饋抑制細胞分裂，使細胞分裂停止。TSCs能持續(xù)通過非對稱分裂，既保留了子代干細胞，又分化新的腫瘤細胞來形成腫瘤塊或者更新凋亡的腫瘤細胞。因此，TSCs不僅失去了密度抑制依賴的特性，而且還使TSCs處于動態(tài)的未分化狀態(tài)。運用細胞因子IL- 15分化治療腎癌，希望通過分化腎癌TSCs使此細胞最終形成高分化細胞，從而失去干細胞特性[19]，但結果注定令人失望。因為NSCCs在腫瘤微環(huán)境下，能轉化成TSCs并獲得干細胞特性[24]。故在未闡明腫瘤微環(huán)境的作用以及TSCs與NSCCs轉化機制前，分化療法將受限制。

5 免疫增強劑在靶向TSCs療法中的應用

適應性免疫是抗腫瘤的主要部分，但由于腫瘤微環(huán)境中不僅缺乏適當?shù)腡細胞共刺激信號和高親和力的T細胞配體來激活T細胞，而且腫瘤微環(huán)境中的Treg細胞和IL- 10、IL- 13和TGF-β等細胞因子共同抑制抗腫瘤免疫反應，使活化的T細胞減少且效率降低﹑適應性免疫反應遲緩，從而導致TSCs處于免疫豁免狀態(tài)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)CTLA- 4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen- 4)和PD- 1(programmed death 1)信號通路與TSCs的免疫豁免狀態(tài)有關，CTLA- 4和PD- 1受體或者配體的抗體等能提高適應性免疫抗TSCs的免疫力[25]。

6 存在問題與展望

隨著研究證實TSCs與腫瘤的發(fā)生﹑發(fā)展﹑轉移和復發(fā)等有著密切關系，TSCs是腫瘤生長的起始細胞，治療腫瘤關鍵可能在于根除TSCs，從而吸引越來越多的國內(nèi)外學者的廣泛關注和研究。免疫療法被認為是繼化療﹑放療和手術后的治療腫瘤的重要方法。靶向標記分子的治療，具有一定的效果。但是，TSCs自我更新和抗原漂移的問題還需要進一步研究。DC疫苗在一定程度上解決了T細胞識別TSCs的問題，但處于腫瘤微環(huán)境的T細胞功能弱，可能需要與T細胞過繼療法結合。NK細胞和CIK細胞是目前最具潛力的抗腫瘤細胞，人體治療也收到良好的療效；但只在特定腫瘤的特定階段起作用，缺乏普遍性，必須進一步研究其治療機制。當前分化療法雖然受限，但隨著機制逐步闡明，此療法可能會是一個不錯選擇。鑒于腫瘤的發(fā)生發(fā)展轉移復發(fā)是多方面多層次的原因，單獨治療效果往往有限，聯(lián)合治療將是必然的趨勢。如細胞因子先活化CIK細胞，然后CIK細胞聯(lián)合DCs抗TSCs，免疫增強劑與過繼免疫聯(lián)合等，所以腫瘤的治療是一個系統(tǒng)的過程，需要整個免疫系統(tǒng)﹑多種免疫方法參與?？偟膩碚f，免疫治療大部分處于理論研究階段，還需要回答很多問題，如實驗所用TSCs是否具有腫瘤的異質性，實驗模型與臨床相關性有多少，免疫細胞與腫瘤微環(huán)境和TSCs的相互作用等。雖然研究成果取得階段性成果，但是距離治愈腫瘤任重而道遠。

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