王平善，劉 陽

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 心外科， 廣西 桂林 541000)

端粒酶(telomerase，TE)是由端粒酶RNA和蛋白質(zhì)所構(gòu)成的核糖核蛋白復(fù)合物，它能以自身RNA 為模板不斷合成端粒DNA 并添加到染色體末端，從而阻止端粒的不斷縮短，進而穩(wěn)定染色體的長度和結(jié)構(gòu)，避免細胞因端粒丟失導(dǎo)致的死亡。在端粒酶的組成中，人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)是TE的催化亞基，是決定其活性的關(guān)鍵基因， 過表達TERT基因可以發(fā)揮端粒對DNA的保護和修復(fù)功能[1- 2]。近年有報道，TERT 基因在生物體中不僅是對端粒的保護作用，而且還具有許多非端粒酶依賴性效應(yīng)，如抗應(yīng)激、調(diào)控線粒體功能、能量代謝、細胞Ca2+分布和促進細胞存活及抗細胞凋亡等[3- 6]。本研究通過構(gòu)建攜帶端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因的重組腺病毒載體，探討端粒酶與細胞增殖和凋亡的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料:Annexin V-APC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒(上海前塵生物科技有限公司)；RNA提取試劑Trizol(TaKaRa公司)；RT-PCR試劑(DBI公司)；自轉(zhuǎn)錄試劑盒(DBI公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(PierceTM BCA Protein Assay Kit)，Rat TE ELISA Kit(E-EL-R0947c)，DEPC(Sigma公司)；RNasin(Promega公司)。

1.1.2 細胞及病毒載體:出生3d的幼鼠心肌細胞(rat cardiac myocytes，RCM)(北京裕恒豐科技有限公司)；TERT siRNA(m)慢病毒載體Lenti-KDTMmiRNA-EGFP和TERT過表達慢病毒載體Lenti-OETMcDNA-EGFP(上海吉凱基因化學(xué)有限公司設(shè)計構(gòu)建)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及處理：參考文獻中建立的心肌細胞低氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxigenation，Hypo/Ro)模型方法[7]，將心肌細胞培養(yǎng)在含體積分數(shù)為10%小牛血清的改良伊戈爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM)，并置于飽和濕度、95%空氣和5% CO2、37 ℃恒溫密閉式培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換1次培養(yǎng)液。實驗時取對數(shù)增殖期細胞，并分為對照組和Hypo/Ro組2組， Hypo/Ro組培養(yǎng)液采用不含血清和不含糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，并置于37 ℃密閉的低氧培養(yǎng)箱中(95% N2和5% CO2)，10 h后置換新鮮培養(yǎng)基，置于含95%空氣和5% CO2的密閉培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，2 h后收集細胞。對照組置于37 ℃常氧培養(yǎng)，12 h后收集細胞。

1.2.2 Real-time PCR檢測TERT、CytC和P21的miRNA表達：Real-time PCR擴增的反應(yīng)體系為：Bestar? SybrGreen qPCRmasterMix 10 μL；PCR正向引物(10 μmol/L) 0.5 μL；PCR反向引物(10 μmol/L)0.5 μL；cDNA 2 μL；ddH2O 7 μL；Total 20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，40個循環(huán)。熔解曲線分析：溫度65 ℃～95 ℃。每個樣重復(fù)3次。實驗按照2-△△Ct方法計算基因相對表達量值。引物設(shè)計： TERT：正義鏈：5′-CCTTGCCA TGTTCCTGTTCTG-3′；反義鏈：5′-GTTGCCTGATTCC AATGCTCT-3′； CytC：正義鏈：5′-CAGGATTTTCTTA CACGGATGC-3′；反義鏈：5′-TGCCTGGGATGTATT TCTTCG-3′；P21：正義鏈：5′-GAACAGTAGACACG AAACAGGC-3′；反義鏈：5′-TATAGAAGGCATCGT CAACACC-3′；GAPDH：正義鏈：5′-CCTCGTCTCA TAGACAAGATGGT-3′；反義鏈：5′-GGGTAGAGT CATACTGGAACATG-3′；實驗按照2-△△Ct方法處理數(shù)據(jù)。

1.2.3 病毒載體的轉(zhuǎn)染：用構(gòu)建好的病毒載體對接種24 h的心肌細胞進行轉(zhuǎn)染，并設(shè)置普通對照組(未轉(zhuǎn)染)，過表達空白組(轉(zhuǎn)染不攜帶TERT基因病毒載體)，TERT過表達組(轉(zhuǎn)染攜帶TERT基因病毒載體)，沉默表達空白組(轉(zhuǎn)染不攜帶TERT siRNA病毒載體)，TERT沉默表達組(轉(zhuǎn)染攜帶TERT siRNA病毒載體)，共5組。每個細胞轉(zhuǎn)染15～20個病毒。使用10% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)3～5 h后按上述方法進行Hypo/Ro處理。提取蛋白并行缺口末端標記法染色(Tunnel染色)。

1.2.4 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后TERT、CytC和P21蛋白濃度：常規(guī)方法提取RCM總蛋白，行SDS-PAGE電泳及轉(zhuǎn)膜。一抗為稀釋后的TERT(稀釋比 1∶400)、CytC(稀釋比 1∶1 000)、P21(稀釋比1∶1 000)抗體及GAPDH抗體，二抗為HRP羊抗兔抗IgG(稀釋比1∶5 000)。BCA試劑顯影后用Image-Pro Plus 6.0凝膠圖象處理系統(tǒng)分析條帶吸光度值，用GAPDH條帶吸光度值進行校正，得出各條帶的相對吸光度值。

1.2.5 流式細胞計量術(shù)檢測Hypo/Ro誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡：取對數(shù)增殖期的RCM懸液6孔板中(5×104/孔)，在37 ℃ 5% CO2孵箱中培養(yǎng)，48 h后用胰蛋白酶將細胞從6孔板中消化，2 000 r/min離心5 min，用4 ℃預(yù)冷的l×磷酸鹽緩沖液洗滌細胞兩次，100 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細胞，再加入10 μL Annexin V-APC混勻后，避光反應(yīng)，冰上孵育10 min后，每管加入380 μL 1×結(jié)合緩沖液后再加入10 μL 7-AAD染色液，1 h內(nèi)進行流式細胞儀檢測。

1.2.6 ELISA測定轉(zhuǎn)染后心肌細胞TE水平：參照伊萊瑞特生物科技有限公司Rat TE ELISA Kit試劑盒說明書進行操作。測量TE在450 nm波長處吸光度值，并根據(jù)標準曲線圖查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)，即為TE的實際濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TERT、P21及CytC表達的變化

Hypo/Ro組TERT及P21的表達明顯低于對照組(P<0.05)，Hypo/Ro組CytC的表達高于對照組(P<0.05)(表1)。

表1 低氧復(fù)氧損傷對心肌細胞相關(guān)基因表達量的影響

*P<0.05 compared with control group.

2.2 病毒轉(zhuǎn)染效率

TERT和P21蛋白的表達在TERT過表達組最高，TERT沉默表達組TERT及P21的表達明顯低于其余各組(P<0.05)。CytC的表達在TERT沉默表達組最高，在TERT過表達組最低(P<0.05)(表2，圖1)。

2.3 TERT表達的變化對缺血再灌注心肌細胞的影響

2.3.1 TERT表達的變化對心肌細胞Hypo/Ro誘導(dǎo)的細胞凋亡的影響。正?；罴毎?Annexin V-APC及7-ADD均低染，分布在流式細胞分析圖的左下區(qū)；早期凋亡細胞Annexin V-APC高染7-ADD低染，分布在圖的右下區(qū)，晚期凋亡或死亡細胞Annexin V-APC及7-ADD均高染， 分布在圖的右上區(qū)。

表2 轉(zhuǎn)染后各組心肌細胞相關(guān)蛋白的表達

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with overexpression control group;#P<0.05 compared with silent control group.

A.TERT overexpression group; B.overexpression control group; C.silent expression control group; D.TERT silent expression group; E.control group圖1 轉(zhuǎn)染后心肌細胞TERT、CytC和P21蛋白的表達Fig 1 Expression of TERT, CytC and P21 proteins in cardiomyocytes after transfection

早期凋亡細胞百分數(shù)和晚期凋亡細胞百分數(shù)之和稱為總凋亡率。Hypo/Ro組與對照組相比心肌細胞早期凋亡率增加，總凋亡率亦增加(P<0.05)。對比轉(zhuǎn)染后心肌細胞，TERT過表達組心肌細胞的凋亡率明顯低于TERT沉默表達組，同時TERT過表達組心肌細胞的凋亡率較I/R組明顯降低，TERT沉默表達組的凋亡率明顯高于Hypo/Ro組(P<0.05)(圖2)。

2.3.2 TERT表達的變化對端粒酶活性的影響。TE蛋白濃度在TERT過表達組最高，在TERT沉默表達組最低(P<0.05)(圖3)。

A.control group; B.Hypo/Ro group; C.TERT overexpression group; D.TERT silent expression group;*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with Hypo/Ro group

3 討論

心肌缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)是心臟外科手術(shù)后最常見的并發(fā)癥之一，其與氧自由基產(chǎn)生、鈣超載、炎性反應(yīng)因子和炎性反應(yīng)細胞聚集等因素有關(guān)，其實質(zhì)是誘導(dǎo)心肌細胞的凋亡。端粒是真核細胞染色體末端的特有結(jié)構(gòu), 隨著細胞的分裂不斷縮短。端粒有一段特殊DNA序列能使染色體不被降解，而端粒酶能穩(wěn)定端粒的長度和結(jié)構(gòu)，從而保護染色體，抑制細胞凋亡[8- 9]?？梢?，通過控制端粒的功能干預(yù)缺血再灌注損傷的過程具有較高的可行性。

TERT是端粒酶活性的主要決定因素，同時具有抑制細胞凋亡的作用。轉(zhuǎn)染外源性TERT可以促進細胞TERT的表達，抑制細胞凋亡。此外TERT還具有DNA修復(fù)功能[10- 11]，能通過調(diào)節(jié)DNA修復(fù)蛋白的表達，促進DNA修復(fù)、穩(wěn)定染色體結(jié)構(gòu)而抑制細胞凋亡。此外，TERT還有可能通過調(diào)節(jié)細胞增增殖[12]來抑制細胞凋亡。

*P<0.05 compared with control group; △P<0.05 compared with overexpression control group; #P<0.05 compared with silent control group圖3 轉(zhuǎn)染后心肌細胞TE蛋白的表達Fig 3 Expression of TE protein in cardiomyocytes

本研究中，外源性TERT的轉(zhuǎn)染促進了體外培養(yǎng)的心肌細胞TERT的表達，增加端粒酶的活性，保護心肌細胞。同時，過表達的TERT可促進細胞內(nèi)P21的表達并抑制CytC的表達。 P21基因為細胞周期的負性調(diào)控因子, 過表達所產(chǎn)生的大量P21蛋白可使細胞周期停于G1期、G2期或S期，抑制DNA 復(fù)制，使受損的細胞得到充分修復(fù)，減少凋亡的發(fā)生[13]。CytC是線粒體起源的細胞凋亡因子，在Hypo/Ro損傷中同樣發(fā)揮重要作用，不僅可直接介導(dǎo)細胞凋亡，而且還能通過干擾電子的傳輸、阻斷能量的合成、促進氧自由基的產(chǎn)生等方式間接參與細胞凋亡[14]。本研究中P21及CytC基因表達的變化，提示它們也參與了TERT對心肌細胞的保護作用，其具體作用機制尚待進一步研究。

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