張海濱 朱磊

機體脂代謝是受相關(guān)調(diào)控因子嚴格控制的生理機制，一旦發(fā)生脂代謝紊亂就會導致肥胖以及動脈粥樣硬化等疾病，嚴重影響 人體健康水平。miRNA在脂代謝相關(guān)疾病中能夠抑制基因表達，從而調(diào)節(jié)病理進程。其中，miR-33是生物體脂代謝發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的重要控制基因。miR-33能夠維持體內(nèi)膽固醇動態(tài)穩(wěn)定，參與高密度脂蛋白(HDL)生成，以及調(diào)節(jié)脂肪酸氧化和胰島素信號釋放。目前國內(nèi)外研究公認，低氧暴露、低氧訓練能夠有效改善機體脂代謝水平。最新研究表明，低氧訓練通過抑制miRNA在肥胖大鼠肝臟表達水平，參與脂代謝生理過程。低氧暴露能夠顯著降低血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)的含量，顯著升高高密度脂蛋白(HDL)的含量，增加血清中高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。低氧訓練可使肥胖SD大鼠肝臟膽固醇逆轉(zhuǎn)運至血液中，并促進脂肪酸氧化。在研究過程中，缺氧訓練顯著降低了miR-33在大鼠肝臟中的表達，但對miR-33在低氧訓練調(diào)控脂代謝通路中的具體功能尚未進行深入研究。本文通過對miR-33，miR-33與脂代謝，以及低氧訓練對脂代謝的調(diào)節(jié)進行綜述，探討低氧訓練誘導miR-33調(diào)控脂代謝通路的可能機制，為低氧訓練減重降脂和脂代謝相關(guān)疾病的干預提供理論依據(jù)。

1. miRNA的生物合成及轉(zhuǎn)錄

miRNA在哺乳動物的生物合成中，大多數(shù)miRNA基因被RNA聚合酶II(RNA Pol II)轉(zhuǎn)錄生成長鏈的初級miRNA轉(zhuǎn)錄物(pri-miRNA)，隨后被加帽聚腺苷酸化并剪接產(chǎn)生pre-miRNA。另有一些miRNA也被RNA酶III(Pol III)轉(zhuǎn)錄。然后核糖核酸酶Ⅲ(RNase-Ⅲ)的DROSHA瞬間將pri-miRNA中間體切割成包含約70-90個核苷酸的莖環(huán)狀pre-miRNA。緊接著由Ran-GTP 依賴性核轉(zhuǎn)運受體 Exportin5將pre-miRNA運送至細胞質(zhì)，并由細胞質(zhì)中Dicer酶進一步處理以產(chǎn)生成熟的miRNA，其長度約為22個核苷酸。成熟的miRNA與Argonaute家族蛋白(AGO)結(jié)合形成RNA誘導沉默復合物(RISC)，RISC通過不完全堿基配對使mRNA的3-UTR與miRNA的“種子”區(qū)域特異性結(jié)合，最后增強mRNA翻轉(zhuǎn)和/或轉(zhuǎn)錄抑制。

miRNA表達受到組織特異性和發(fā)育階段異性控制。大多數(shù)miRNA基因轉(zhuǎn)錄是由RNA Pol II介導的，他們的啟動子在蛋白質(zhì)基因編碼中被認為具有序列特征和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。事實上，高通量測序和生物信息學方法已經(jīng)揭示，miRNA基因近端上游區(qū)域具有TATA盒、啟動子元素、TFIIB識別元素(TFIIB recognition element，BRE)和大量轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序。此外，最近的研究已經(jīng)預測miRNA啟動子區(qū)域接近轉(zhuǎn)錄起始位點，暗示表觀遺傳機制，如DNA甲基化和組蛋白修飾對miRNA表達調(diào)控的作用。為了更好地理解miRNA基因的多樣性、功能和生物合成，需要關(guān)于替代、剪接啟動子和miRNA基因加工的更詳細信息。

2. microRNA-33

位于甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)中的內(nèi)含子miR-33有助于維持體內(nèi)膽固醇平衡，影響高密度脂蛋白(HDL)生命周期，改善脂肪酸代謝和胰島素信號釋放。值得注意的是，人類基因中存在兩類miR-33,一類是存在于染色體22上srebp-2基因內(nèi)含子16中的miR-33a，另一類存在于染色體17上srebp-1基因內(nèi)含子17中的miR-33b。然而在小鼠體內(nèi)只有一類存在與srebp-2基因內(nèi)含子15中的miR-33，并與人類miR-33a高度保守。盡管miR-33a/b與宿主SREBP基因共同轉(zhuǎn)錄以及翻譯蛋白，但是完全獨立調(diào)節(jié)脂代謝。肝臟是脂肪酸氧化和膽固醇生成的重要場所，而且miR-33在肝臟表達量最為顯著，這些表明了肝臟miR-33對調(diào)控機體脂代謝具有重要意義。

3. miRNA-33和脂代謝

miR-33能夠直接或者間接影響相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白和催化酶的活性，參與膽固醇運輸、合成和脂肪酸β氧化，在脂代謝過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。

3.1 miRNA-33和膽固醇代謝

膽固醇轉(zhuǎn)運體，ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1 (ABCA1)促進膽固醇外流至細胞外受體，形成新生的高密度脂蛋白(HDL)顆粒。這個過程是膽固醇逆轉(zhuǎn)運(RCT)的第一步，多余的膽固醇從外周細胞轉(zhuǎn)運至肝臟，以便外排到膽汁和糞便中。肝臟ABCA1失活會導致小鼠體內(nèi)總HDL-c嚴重減少。由于血漿HDL-C水平與心血管疾病呈負相關(guān)，因此ABCA1介導的膽固醇流出對于維持膽固醇動態(tài)平衡和防止動脈粥樣硬化至關(guān)重要。May等，將可能與膽固醇代謝相關(guān)的miRNA和已知脂代謝轉(zhuǎn)錄因子進行基因分析，鑒定出人類SREBP-2內(nèi)含子16的序列與miR-33相對應序列高度保守。隨后運用熒光素基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，表明人類和小鼠ABCA1以及小鼠ABCG1的3-UTR區(qū)含有miR-33互補序列。利用編碼miR-33的腺病毒轉(zhuǎn)染實驗更加確定，人類和小鼠ABCA1和小鼠ABCG1是miR-33真正地靶標基因。最后進行的體外和體內(nèi)實驗數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，miR-33過表達導致膽固醇向Apoa1的運輸減少，說明miR-33過表達降低細胞排出膽固醇的能力。小鼠體內(nèi)注射miR-33腺病毒導致ABCA1mRNA和蛋白質(zhì)減少，血漿總膽固醇下降19%。與注射空白腺病毒小鼠相比，HDL-C降低29%。相反的，注射反義寡核苷酸miR-33腺病毒的小鼠體內(nèi)ABCA1表達和HDL水平顯著增加。這些研究數(shù)據(jù)強烈表明，miR-33調(diào)節(jié)細胞內(nèi)膽固醇外流和脂蛋白代謝的可能機制是抑制ABCA1的表達。Katey等在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，miR-33和SREBP-2表達由膽固醇負荷協(xié)調(diào)下調(diào)。miR-33水平與膽固醇水平和ABCA1表達呈負相關(guān)，與SREBP-2mRNA水平呈正相關(guān)。并且通過檢測小鼠組織和各種細胞系中的miR-33表達水平顯示，除巨噬細胞外，miR-33在小鼠和人的肝臟細胞中高度表達，在內(nèi)皮細胞中表達較少。但是，miR-33在人源性細胞中強烈抑制NPC1蛋白表達，而小鼠中并未有影響。此外，miR-33轉(zhuǎn)染的人巨噬細胞、肝細胞和內(nèi)皮細胞中ABCG1同樣沒有影響。保守地分析顯示，小鼠ABCA1和NPC1的3-UTR中預測的miR-33靶位點高度保守，但ABCG1的3-UTR中miR-33的推定位點僅存在于小鼠中。為評估m(xù)iR-33對人和小鼠ABCA1、ABCG1和NPC1的3-UTR影響，利用熒光素酶報告基因構(gòu)架技術(shù)，鑒定ABCA1和NPC1為miR-33的保守靶標，而ABCG1僅為小鼠中miR-33靶標。內(nèi)源性miR-33拮抗作用增加了小鼠和肝細胞中ABCA1表達和膽固醇流出至apoA1。在膽固醇過量消耗的條件下，抑制miR-33顯著增加巨噬細胞和肝細胞中膽固醇流出。細胞操作miR-33表達改變巨噬細胞膽固醇流出，這是膽固醇轉(zhuǎn)運途中過量膽固醇轉(zhuǎn)運至肝臟的第一步。miR-33體內(nèi)過表達主要影響ABCA1調(diào)控HDL生成階段，導致血漿HDL含量逐漸下降，6天后將至22%。相反，抗miR-33表達小鼠6天后顯示肝ABCA1蛋白增加50%，血漿HDL水平升高25%。因此控制體內(nèi)miR-33水平可改變ABCA1表達和HDL-c的動員。這些實驗結(jié)果表明，在肝臟中的HDL生物發(fā)生過程中，miR-33操縱ABCA1對循環(huán)HDL水平影響；在細胞膽固醇流出過程中，miR-33調(diào)節(jié)HDL和apoA1通過這一途徑將過量膽固醇轉(zhuǎn)移回肝臟進行排泄。Najaf等在研究SREBP基因調(diào)控期間發(fā)現(xiàn)，成熟形式的miR-33a/b與所檢測的人和小鼠組織中的SREBP基因共同表達。利用siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)，清楚地表明ABCA1表達被過量的miR-33抑制，特別是在小鼠J774巨噬細胞和人IMR-90成纖細胞中，當細胞系引入抗miR-33時ABCA1的水平顯著增加。這些數(shù)據(jù)表明，ABCA1蛋白的表達受到miR-33調(diào)控。而這種調(diào)控是miR-33通過靶向ABCA1基因的3-UTR翻譯抑制或mRNA降解實現(xiàn)。miR-33轉(zhuǎn)錄后抑制ABCA1導致巨噬細胞內(nèi)膽固醇保留，調(diào)控膽固醇轉(zhuǎn)錄；而LAN-miR-33a反義處理的小鼠體內(nèi)血漿HDL-c濃度明顯增加?？傊?，此項研究表明miR-33對ABCA1進行轉(zhuǎn)錄后控制，對膽固醇運輸和HDL合成具有重要影響。綜上研究及其他獨立研究證實，miR-33通過翻譯抑制ABCA1、ABCG1和NPC1的表達協(xié)調(diào)控制細胞膽固醇流出，影響膽固醇反轉(zhuǎn)運至肝臟的轉(zhuǎn)運途徑，并通過ABCA1調(diào)節(jié)體內(nèi)HDL水平，增加血漿中HDL-c含量。

最新研究普遍認為，內(nèi)源性的miR-33抑制是治療動脈粥樣硬化的可行性手段。Katey等評估動脈粥樣硬化風險時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過4周miR-33抑制處理的小鼠顯示，循環(huán)HDL水平升高，細胞膽固醇逆向轉(zhuǎn)運增加，血漿、肝臟和糞便膽固醇含量升高；并且粥樣硬化斑塊大小和脂質(zhì)含量減少，炎癥基因表達降低，動脈粥樣硬化逐漸消退。miR-33缺失的小鼠體內(nèi)ABCA1和ABCG1蛋白增加，巨噬細胞膽固醇外流加大，血漿中HDL-c含量顯著升高，有效阻止動脈粥樣硬化的發(fā)展。

3.2 miRNA-33和脂肪酸代謝

脂肪酸β氧化是脂代謝過程中的關(guān)鍵步驟，促使脂肪降解成水、二氧化碳并釋放能量的過程。在對miR-33參與膽固醇代謝研究過程中驚奇的發(fā)現(xiàn)miR-33同樣參與脂肪酸氧化。Lswblie等，在研究miR-33對膽固醇代謝影響時注意到， miR-33抑制脂肪酸氧化蛋白HADHB和CPT1A表達水平，似乎能夠抑制脂肪酸的氧化。而且miR-33過表達減少了線粒體20%的β氧化，TCL分析細胞提取物時，細胞內(nèi)游離脂肪酸水平和膽固醇顯著增加。Alberot等在研究時證實了，miR-33參與調(diào)節(jié)脂肪酸代謝的基因。使用Pathway Studio 7軟件進行基因本體和生物學關(guān)聯(lián)分析，預測了miR-33參與脂肪酸β氧化的目標基因，包括CROT，CPT1A，HADHB和AMPKα。miR-33b顯著抑制熒光素酶構(gòu)建體CROT，CPT1A，HADHB和AMPKα的3-UTR活性以及mRNA表達。相反，表達抗miR-33b的小鼠表現(xiàn)出CROT，CPT1A，HADHB和AMPKα表達適度增加，盡管沒有統(tǒng)計學意義。評估m(xù)iR-33對脂肪酸β氧化的影響顯示，miR-33b過表達顯著降低Huh7細胞中的脂肪酸β氧化，積累更多甘油三酯。相反，抑制內(nèi)源性miR-33表達增加脂肪酸β氧化速率。類似地，過度表達的miR-33在果蠅饑餓時累積了更多甘油三酯，表明miR-33從果蠅到人類都能夠調(diào)控脂肪酸氧化。另有研究表明， miR-33缺陷癥增加了肝臟和脂肪組織中的SREBP-1水平，脂肪酸合成和脂肪酸積累。在飲食誘導的肥胖小鼠模型中證明，miR-33治療性沉默促進全身氧化代謝。

4.低氧訓練對脂代謝的調(diào)節(jié)

已經(jīng)證實，低氧訓練可以有效改善脂代謝，減輕體重。低氧環(huán)境下的耐力運動上調(diào)脂肪酸β氧化關(guān)鍵酶CPT1的mRNA表達，改善營養(yǎng)性肥胖大鼠骨骼肌脂肪代謝?，F(xiàn)階段更多的關(guān)注點是低氧訓練誘導miRNA調(diào)控脂代謝相關(guān)基因的研究。朱磊[5]等研究表明，低氧訓練誘導miR-27和miR-122表達下調(diào)，PPARγ 和 PPARβ表達上調(diào)，進而影響CPT1、FAS、ACC、CYP7A1、CD36、SREBP1基因表達促進膽固醇代謝、HDL-c轉(zhuǎn)運和脂肪酸氧化。并且該項目組尚未發(fā)表的研究證明，低氧訓練顯著降低了肝臟miR-33表達，但遺憾的是未對miR-33在低氧訓練調(diào)節(jié)脂代謝中的調(diào)控進一步研究。

5.結(jié)論與展望

miR-33是脂代謝的重要調(diào)控因子，通過調(diào)控脂代謝相關(guān)基因表達促進膽固醇流出、HDL-c濃度以及脂肪酸β氧化，影響機體脂代謝水平。低氧訓練刺激miRNA表達水平的改變調(diào)控脂代謝相關(guān)基因參與脂代謝。但目前關(guān)于低氧訓練對miR-33表達水平的研究尚未有發(fā)表的數(shù)據(jù)，以及低氧訓練調(diào)控脂代謝是否是誘導miR-33表達水平的改變導致尚未研究。因此，低氧訓練干預miR-33水平表達調(diào)節(jié)脂代謝，不僅豐富了脂代謝miRNA分子學機制，而且為運動減脂降重和動脈粥樣硬化治療提供更多科學支持。