陳雪平，宋曉丹

（1.水中銀（國(guó)際）生物科技有限公司（香港）香港，999077；2.圣元營(yíng)養(yǎng)食品有限公司北京營(yíng)養(yǎng)研究院，北京100020）

0 引言

雌激素安全是乳制品行業(yè)近年關(guān)注的焦點(diǎn)之一。雖業(yè)界及政府部門(mén)普遍認(rèn)為牛奶中的內(nèi)源性雌激素對(duì)于人體無(wú)害，國(guó)際研究卻指出內(nèi)源雌激素亦會(huì)干擾人體內(nèi)分泌系統(tǒng)，且影響并不亞于外源性雌激素[1]。有鑒于此，文中以ChgH-GFP轉(zhuǎn)基因鯖鳉魚(yú)自由胚胎測(cè)試雌激素為例，首創(chuàng)提出應(yīng)用“有害結(jié)局路徑”思維把關(guān)乳制品雌激素安全。闡述通過(guò)測(cè)量雌激素“有害結(jié)局路徑”中的某些位點(diǎn)，如被誘導(dǎo)ChgH基因的表達(dá)，來(lái)測(cè)量乳制品中的總體雌激素水平，并建議按照聯(lián)合糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專(zhuān)家委員會(huì)設(shè)立的雌二醇每日允許攝入量[2]探討乳制品的雌激素安全閾值。

1 乳制品中的雌激素內(nèi)分泌干擾素污染問(wèn)題

工業(yè)化的畜牧業(yè)基于成本效益，產(chǎn)奶的奶牛一般都處于懷孕期，導(dǎo)致生產(chǎn)的牛奶會(huì)有較高量的雌激素及孕酮。此外，使用雌激素、雌二醇及其衍生物于母畜身上亦有助于提高產(chǎn)奶量及延長(zhǎng)產(chǎn)奶期，而激素的殘留時(shí)間較長(zhǎng)，養(yǎng)殖期間使用的激素很大可能會(huì)殘留于牛奶中。除了牛奶中的天然激素及養(yǎng)殖過(guò)程中外加的合成激素，在乳制品制作過(guò)程中亦存在受雌激素內(nèi)分泌干擾物污染的風(fēng)險(xiǎn)。有實(shí)驗(yàn)證明牛奶中的確含有一定份量的雌激素代謝產(chǎn)物[2]，并發(fā)現(xiàn)九成國(guó)內(nèi)外嬰幼兒配方奶粉含有會(huì)影響雌激素內(nèi)分泌系統(tǒng)平衡的孕酮[3]。牛奶被視為人類(lèi)吸收雌激素的主要食物來(lái)源之一。有研究發(fā)現(xiàn)，測(cè)試者飲用牛奶后血液及尿液中的激素含量的確有所提升[1]，證明乳制品中含有足以影響飲用者雌激素內(nèi)分泌系統(tǒng)的物質(zhì)。

聯(lián)合國(guó)環(huán)境保護(hù)署和世界衛(wèi)生組織于2012年發(fā)布的關(guān)于《內(nèi)分泌干擾素現(xiàn)狀》的聯(lián)合報(bào)告中指出，雌激素會(huì)影響性器官及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，可能引致生育能力下降，性早熟、肥胖、內(nèi)分泌失調(diào)和精神紊亂，對(duì)于處于急速成長(zhǎng)期的嬰幼兒童影響尤其嚴(yán)重[4]。嬰幼兒一旦受到荷爾蒙干擾，所造成的影響可能會(huì)到青春期才顯示出來(lái)。有關(guān)雌激素類(lèi)物質(zhì)對(duì)猴子雄性嬰兒影響的深入研究指出，雄性猴子于幼兒期間內(nèi)分泌系統(tǒng)一旦受到干擾，除了導(dǎo)致延遲踏入青春期外，更會(huì)降低成年后的生育能力和骨質(zhì)密度，并對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成永遠(yuǎn)久傷害[5]。嬰幼兒奶粉為成長(zhǎng)中嬰幼兒的主食，其雌激素安全性問(wèn)題必須重視。

2 雌激素作用機(jī)制及安全把關(guān)的挑戰(zhàn)性問(wèn)題

雌激素對(duì)生物體的主要功能是維護(hù)生理平衡和促進(jìn)并維護(hù)女性的第二性征。雌激素對(duì)生物體的作用主要是通過(guò)與雌激素受體結(jié)合，啟動(dòng)雌激素信號(hào)傳遞通路，即調(diào)控雌激素受體下游基因表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。內(nèi)源性雌激素的作用機(jī)制如此，外源性雌激素的作用機(jī)制也是如此，而某些本身不具雌激素功能的化合物則有可能通過(guò)干擾雌激素和雌激素受體之間的相互作用，從而起到增強(qiáng)或抑制雌激素活性的作用。由此可見(jiàn)，在討論乳制品雌激素安全時(shí)，只是關(guān)注幾種內(nèi)源或外源雌激素是不夠的。

我國(guó)農(nóng)業(yè)部早在2002年就已禁止使用己烯雌酚等合成雌激素藥物，并規(guī)定食品中不得檢出該類(lèi)物質(zhì)。然而最新的《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》有關(guān)乳制品的規(guī)定中并未列明關(guān)于雌激素的監(jiān)管[6-8]。乳制品中雌激素水平測(cè)試多半停留在學(xué)術(shù)研究層面，且主要為氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法，液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法高效液相色譜－四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜等化學(xué)分析方法[9-10]。這些方法雖可測(cè)出特定雌激素于樣本中的精確含量，但程序較為繁復(fù)，且不能同時(shí)測(cè)試出未知雌激素。退一步說(shuō)，即使化學(xué)分析可以測(cè)試出乳制品中所有的雌激素內(nèi)分泌干擾素，目前的毒理學(xué)知識(shí)也還不足以評(píng)估多種物質(zhì)混合在一起時(shí)的總體生物學(xué)效應(yīng)。

3 應(yīng)用有害結(jié)局路徑評(píng)估乳制品雌激素安全

有害結(jié)局路徑這個(gè)概念是2010年正式提出的[11]，是用于描述分子起始事件（如：雌激素與雌激素受體相互作用）與在生物不同組織結(jié)構(gòu)層次（如：基因、細(xì)胞、器官、機(jī)體、群體）中出現(xiàn)的與危險(xiǎn)度評(píng)定相關(guān)的“有害結(jié)局”之間的相互聯(lián)系。有害結(jié)局路徑已經(jīng)成為了構(gòu)建毒理學(xué)知識(shí)框架、以支持基于機(jī)理機(jī)制所進(jìn)行的化學(xué)品安全評(píng)估的核心元素。當(dāng)一種化合物與生物中的分子相互作用，經(jīng)過(guò)一系列于生物不同組織結(jié)構(gòu)層次中的傳遞，最終出現(xiàn)個(gè)體或社會(huì)群體層面的有害結(jié)局。整個(gè)有害結(jié)局路徑可以用來(lái)概括某種化合物對(duì)生物造成的傷害，亦可以預(yù)測(cè)其它擁有相同生物活性的化合物對(duì)生物造成傷害的風(fēng)險(xiǎn)?？偟膩?lái)說(shuō)，有害結(jié)局路徑這一概念框架強(qiáng)調(diào)的是風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估應(yīng)著眼于有關(guān)物質(zhì)對(duì)生物造成的傷害[12-14]。

將有害結(jié)局路徑這一毒理學(xué)思路應(yīng)用到探討乳制品雌激素安全問(wèn)題上時(shí)，關(guān)注的應(yīng)該是雌激素所造成的“有害結(jié)局”，而非雌激素是屬于內(nèi)源還是外源性問(wèn)題。原因在于不論是內(nèi)源或外源雌激素，在生物體內(nèi)都會(huì)啟動(dòng)雌激素信號(hào)傳遞通路，通過(guò)改變基因表達(dá)最終對(duì)生物造成“有害結(jié)局”。因此，通過(guò)檢測(cè)和“有害結(jié)局”相關(guān)聯(lián)的基因表達(dá)的改變更能保障食用者健康。

4 轉(zhuǎn)基因魚(yú)自由胚胎測(cè)試雌激素技術(shù)

基于對(duì)雌激素作用機(jī)制的深入了解和研究，我們基于雌激素的“有害結(jié)局路徑”研發(fā)了應(yīng)用轉(zhuǎn)基因鯖鳉魚(yú)（Oryzias melastigma）自由胚胎（eleutheroembryo）測(cè)試樣品中的總體雌激素水平（雌激素當(dāng)量，即相當(dāng)于多少雌二醇）的技術(shù)[15-17]。雌激素對(duì)鯖鱂魚(yú)的作用機(jī)制和對(duì)我們?nèi)梭w相似，也是通過(guò)和雌激素受體結(jié)合后啟動(dòng)雌激素受體下游基因表達(dá)的改變而造成“有害結(jié)局”的。鯖鱂魚(yú)卵殼內(nèi)膜蛋白基因ChgH是雌激素依賴的雌激素受體下游基因[18]。當(dāng)帶有卵殼內(nèi)膜蛋白基因啟動(dòng)子連接著綠色熒光蛋白（GFP）基因編碼區(qū)的轉(zhuǎn)基因鯖鳉魚(yú)自由胚胎遇到具有雌激素活性的物質(zhì)時(shí)，其卵殼內(nèi)膜蛋白基因啟動(dòng)子就會(huì)響應(yīng)上游雌激素受體的調(diào)控，啟動(dòng)綠色熒光蛋白基因的表達(dá)合成綠色熒光蛋白。合成的綠色熒光蛋白的多少與雌激素量呈正相關(guān)。因此，將自由胚胎暴露于待測(cè)溶液一段時(shí)間（如24 h）后，于熒光顯微鏡下觀察并測(cè)量綠色熒光蛋白的熒光強(qiáng)度，通過(guò)比較樣品所誘導(dǎo)的熒光強(qiáng)度和雌二醇的熒光強(qiáng)度-劑量反應(yīng)曲線便可計(jì)算出樣品的雌激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。在24 h暴露的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試程序下，該方法對(duì)雌二醇的檢測(cè)限為1μg/L。當(dāng)樣品和一定量雌二醇同時(shí)暴露時(shí)，該方法還可測(cè)出樣品是否具有增強(qiáng)或抑制雌激素活性[19]。

5 轉(zhuǎn)基因魚(yú)自由胚胎測(cè)試的技術(shù)優(yōu)勢(shì)

轉(zhuǎn)基因鯖鳉魚(yú)自由胚胎測(cè)試雌激素當(dāng)量技術(shù)是通過(guò)對(duì)雌激素“有害結(jié)局路徑”中的雌激素受體下游基因ChgH的表達(dá)進(jìn)行可視化實(shí)現(xiàn)的。由于ChgH是雌激素受體下游基因，該技術(shù)所測(cè)試的是和雌激素受體結(jié)合后成功啟動(dòng)了雌激素“有害結(jié)局路徑”的物質(zhì)，避免了假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。同時(shí)該方法測(cè)試的是樣品中的所有雌激素內(nèi)分泌干擾素對(duì)于生物體造成的影響，反應(yīng)了樣品經(jīng)過(guò)生物吸收，體內(nèi)轉(zhuǎn)化以及物質(zhì)間相互作用后導(dǎo)致的最終生物學(xué)效應(yīng)。

該測(cè)試應(yīng)用的鯖鱂魚(yú)是一種大小和生長(zhǎng)周期都類(lèi)似于斑馬魚(yú)（Danio rerio）的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物模型，具有個(gè)體?。ǔ婶~(yú)3～4 cm），繁殖力強(qiáng)(約200粒魚(yú)卵/周/對(duì)魚(yú))，生殖周期短（從魚(yú)卵到產(chǎn)卵期約為3～4個(gè)月），早期發(fā)育透明（方便觀察）等優(yōu)勢(shì)。根據(jù)歐盟最新動(dòng)物保護(hù)法[20]，魚(yú)的胚胎和自由胚胎不被界定為動(dòng)物，是國(guó)際科學(xué)家大力推崇以替代動(dòng)物測(cè)試的方法之一。因此該方法為動(dòng)物測(cè)試替代法。

6 轉(zhuǎn)基因魚(yú)自由胚胎測(cè)試乳制品雌激素案例示范

作者嘗試將該技術(shù)應(yīng)用于測(cè)試乳制品中的雌激素水平。于2012-2013年對(duì)香港市場(chǎng)上8大國(guó)際品牌之29個(gè)嬰幼兒奶粉(其中有些是屬于同一品牌同一階段不同批次的奶粉)樣品(表1)進(jìn)行了收集和測(cè)試。樣品經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑提取后稀釋于水溶液中，轉(zhuǎn)基因鯖鳉魚(yú)自由胚胎暴露于稀釋液中24h后于熒光顯微鏡下測(cè)量所誘導(dǎo)的綠色熒光強(qiáng)度并分析計(jì)算出樣品的雌激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。測(cè)試結(jié)果顯示3大品牌之8個(gè)樣品檢測(cè)出雌激素活性（表1），其中5個(gè)為6～12個(gè)月嬰兒奶粉，雌激素當(dāng)量為14～64 ng/g雌二醇；2個(gè)為1～3歲幼兒奶粉，雌激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80 ng/g雌二醇；1個(gè)為6～12歲兒童成長(zhǎng)配方奶粉，雌激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14 ng/g雌二醇。

表1 奶粉樣品信息及雌激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)試結(jié)果

上述所測(cè)的大品牌產(chǎn)品在雌激素含量上應(yīng)該都能達(dá)到法定要求，然而應(yīng)用轉(zhuǎn)基因鯖鳉魚(yú)自由胚胎測(cè)試雌激素當(dāng)量技術(shù)卻發(fā)現(xiàn)多個(gè)產(chǎn)品具有一定量的雌激素活性。如果參照J(rèn)ECFA設(shè)立的雌二醇安全攝入量（0～50 ng/kg體質(zhì)量）[2]，嬰幼兒體重以及奶粉包裝上建議的每日喂哺量，那5個(gè)6～12個(gè)月以及2個(gè)1～3歲陽(yáng)性奶粉樣品在雌激素安全問(wèn)題上值得關(guān)注。這表明單靠現(xiàn)有法規(guī)在把關(guān)乳制品雌激素安全問(wèn)題上存在風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)也證明了該轉(zhuǎn)基因魚(yú)自由胚胎測(cè)試技術(shù)可作為一種快速可靠的乳制品雌激素安全篩查工具，防止因雌激素，特別是法規(guī)外的雌激素內(nèi)分泌干擾素污染而造成的乳制品安全隱患。

7 雌激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)試于乳制品行業(yè)的應(yīng)用前景

當(dāng)明白內(nèi)源和外源雌激素都會(huì)對(duì)生物體造成相同的“有害結(jié)局”時(shí)，我們關(guān)注的不應(yīng)該是乳制品中是否含有某種外源雌激素，而是乳制品中的雌激素總量是否達(dá)到對(duì)人體可能造成傷害的水平。根據(jù)有害結(jié)局路徑這一毒理學(xué)概念，本文提出了通過(guò)測(cè)量生物體的“有害結(jié)局路徑”中的敏感基因的表達(dá)量改變來(lái)量化乳制品的總體雌激素水平。從毒理學(xué)角度來(lái)講這種毒理評(píng)估方式比只分析某一種或幾種雌激素濃度更全面。根據(jù)國(guó)際食品法典委員會(huì)關(guān)于現(xiàn)代生物技術(shù)所產(chǎn)食品風(fēng)險(xiǎn)分析原則”（CODEX CAC/GL 44-2003），當(dāng)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估相關(guān)的新的科學(xué)信息可獲得時(shí)應(yīng)進(jìn)行評(píng)估和予以采納[21]。本文中所講述的轉(zhuǎn)基因鯖鱂魚(yú)自由胚胎測(cè)試雌激素當(dāng)量技術(shù)正屬于“新的科學(xué)信息”，可用來(lái)有效測(cè)量和評(píng)估乳制品以及其它食品中的總體雌激素水平，從而幫助乳制品生產(chǎn)商和相關(guān)檢測(cè)部門(mén)發(fā)現(xiàn)雌激素安全隱患、采取措施、提升產(chǎn)品安全！至于乳制品中雌激素當(dāng)量閾值設(shè)置為多少方可確保食用者安全這一問(wèn)題則亟待進(jìn)一步研究。

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