米智慧，陳永福，張和平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室奶制品加工農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018）

0 引言

發(fā)酵乳系指牛乳等動(dòng)物乳經(jīng)乳酸菌發(fā)酵工藝而制成的一大類(lèi)乳制品，是營(yíng)養(yǎng)與保健功能兼?zhèn)涞氖称分籟1-3]。因此有機(jī)酸組成及含量的測(cè)定對(duì)評(píng)價(jià)發(fā)酵乳品質(zhì)具有重要作用。

如今測(cè)定有機(jī)酸的方法主要有：毛細(xì)管電泳法[4-5]、離子排斥色譜法[6-7]、高效液相色譜法[8-10]、氣相色譜法[11]、氣相質(zhì)譜聯(lián)用法[12-13]和超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用法等[14-15]。液相質(zhì)譜法相對(duì)于其它方法具有分離效果好、分離速度快、檢出限低、分辨率高、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，并且對(duì)于有機(jī)酸的種類(lèi)能明確判別。Huang Y與Xiang G等[16-17]利用該方法對(duì)有機(jī)酸進(jìn)行定量分析。因此，本研究擬充分利用對(duì)極性化合物具有極佳保留特性的亞1.8μm顆粒的色譜柱ACQU ITY?HSS T 3，建立快速、靈敏的LC-M S方法并將其應(yīng)用于發(fā)酵乳樣品的定量分析。

1 實(shí)驗(yàn)

（1）儀器。Waters ACQU ITY UPLC-QTOF MS超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，Waters MassLynx 4.1及QuanLynx工作站，Milli-Q純水儀。

（2）試劑。超純水（Milli-Q超純水機(jī)制備），甲酸、甲酸鈉（純度為99%），乙腈（Optima?LC-M S級(jí)）。

（3）樣品預(yù)處理。將發(fā)酵乳樣品解凍后，準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g于10 mL的EP管中，加1 mol/L HCL 4 mL，漩渦混勻后，取1.5mL混合液于2 m LEP管中，11 000 g高速離心5 min，取1 mL上清液經(jīng)0.22μm膜過(guò)濾于樣品瓶中，待測(cè)備用。

（4）LC-M S條件。色譜柱W atersHSST 3（1.8μm，2.1mm×100mm），柱溫30℃，流動(dòng)相分別為（A）0.1%甲酸/1mmol/L甲酸銨溶液-（B）乙腈溶液，梯度洗脫條件（0～0.5 min，3%～3%B；0.5～3 min，3%～10%B；3～4 min，10%～30%B；4～5 min，30%～30%B；5～5.3 min，30%～3%B，運(yùn)行時(shí)間6 min），流速0.25 mL/min，進(jìn)樣體積5.0μL。質(zhì)譜檢測(cè)采用ESI負(fù)離子模式，毛細(xì)管電壓2.5 kV，錐孔電壓40 V，離子源溫度100℃，脫溶劑氣溫度450℃，錐孔氣流量50 L/h，脫溶劑氣流量600 L/h，并且以亮氨酸-腦啡肽[M-H=554.2615]作為質(zhì)量校正軸的參比物。

（5）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制。分別準(zhǔn)確稱(chēng)取乙酸，乳酸，琥珀酸0.02 g，用超純水充分溶解，再定容到100 mL，乙酸，乳酸，琥珀酸的質(zhì)量濃度為200μg/mL，此溶液作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再逐級(jí)進(jìn)行稀釋?zhuān)涑少|(zhì)量濃度為0.1，0.5，1，2，5μg/mL的混合標(biāo)樣，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。以上?個(gè)不同質(zhì)量濃度的標(biāo)樣各進(jìn)樣5.0μL，測(cè)得峰面積（Y），繪制峰面積（Y）與質(zhì)量濃度（X）的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如表2所示，各化合物在各自濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性良好。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 色譜柱的選擇

有機(jī)酸帶有羧基（-COOH），具有較強(qiáng)的極性，因此適合極性色譜柱。陳永福等[17]采用ZorbaxC 18SB-Aq色譜柱對(duì)發(fā)酵乳中的有機(jī)酸進(jìn)行分析，雖具有分離效果，但分析時(shí)間較長(zhǎng)，且靈敏度低，檢出限高，無(wú)法檢測(cè)到含量較小的有機(jī)酸。此外，劉瑤等[18]采用親水作用色譜-質(zhì)譜（H ILIC-LC-M S）測(cè)定參附注射液中的有機(jī)酸，但平衡色譜柱時(shí)間較長(zhǎng)。本研究選用對(duì)極性化合物具有最佳保留特性的亞1.8μm顆粒的色譜柱W aters ACQU ITY?HSS T 3色譜柱對(duì)發(fā)酵乳中有機(jī)酸進(jìn)行分離。

2.1.2 緩沖液及濃度選擇

乙酸，乳酸和琥珀酸等有機(jī)酸的pKa值范圍在3.5～4.5左右，為了抑制有機(jī)酸的電離，本研究選擇緩沖液pH值為2。液相色譜一般采用磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相對(duì)樣品進(jìn)行分離，但磷酸是非揮發(fā)酸，對(duì)液相及質(zhì)譜都有一定的損害，所以本研究采用了甲酸銨緩沖液。由于有機(jī)酸具有較強(qiáng)的極性，利用相似相溶的原理，在流動(dòng)相中加入了體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸。

本研究分別采用3種不同流動(dòng)相，以梯度洗脫（梯度洗脫條件如表1）的形式進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證：A為0.1%甲酸水溶液與乙腈溶液，B為0.1%甲酸-5mm oL甲酸銨溶液與乙腈溶液，C為0.1%甲酸-1 mm o l/L甲酸銨溶液與乙腈溶液。結(jié)果表明，流動(dòng)相A使目標(biāo)化合物有雜峰，基線(xiàn)較高，色譜峰有毛刺；B中加了甲酸銨緩沖液后其峰型明顯改善，無(wú)雜峰，峰型窄且尖，無(wú)毛刺且保留時(shí)間穩(wěn)定無(wú)漂移，改變緩沖液濃度，流動(dòng)相B體系與C體系在色譜柱上的保留效果基本一致。但是考慮到高濃度的緩沖鹽體系會(huì)對(duì)色譜柱及溶劑管理器有一定的損害，且會(huì)對(duì)質(zhì)譜噴霧造成影響，所以采用0.1%甲酸-1 mm ol/L甲酸銨溶液與乙腈作為流動(dòng)相。當(dāng)流動(dòng)相流速為0.2 mL/min時(shí)，流速較低，色譜圖峰形較寬；當(dāng)流速為0.25 mL/min與0.3 mL/min的流速對(duì)色譜峰型并無(wú)太大影響，考慮到質(zhì)譜噴霧效果，故采用0.25 mL/min作為最優(yōu)流速。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫

圖1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜

2.2 線(xiàn)性范圍與檢出限

將混合標(biāo)樣進(jìn)行逐級(jí)稀釋?zhuān)吹蜐舛鹊礁邼舛冗M(jìn)行序列進(jìn)樣，得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積以及響應(yīng)值。以有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積為縱坐標(biāo)，溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制，計(jì)算回歸方程和線(xiàn)性系數(shù)，同時(shí)以信噪比（S/N）為3∶1和10∶1為基準(zhǔn)分別測(cè)得各化合物的檢出限和定量限，結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，各化合物在其濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性較好，定量限范圍為10～200 ng/mL，檢出限范圍為2.5～40 ng/mL。

表2 有機(jī)酸的線(xiàn)性范圍、線(xiàn)性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出與定量限 μg/mL

2.3 精密度與回收率實(shí)驗(yàn)

分別向已知濃度的樣品中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液（分別相當(dāng)于發(fā)酵乳原有質(zhì)量分?jǐn)?shù)的80%，100%和120%），每一質(zhì)量分?jǐn)?shù)3份，每一加標(biāo)溶液進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn)，按照1（4）中的方法，液質(zhì)條件進(jìn)行UPLC-M S分析，記錄峰面積，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果如表3所示。有機(jī)酸加樣回收率范圍93.5%～106.07%，各物質(zhì)的回收率符合標(biāo)準(zhǔn)回收率范圍（100%±20%），RSD均小于7%，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)的精密度良好。

表3 回收率與精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究基于UPLC-M S建立了發(fā)酵乳中乙酸、乳酸與琥珀酸的檢測(cè)方法。試驗(yàn)選用ACQU ITY?HSST3色譜柱，以用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸水溶液與乙腈溶液，0.1%甲酸-5mm ol/L甲酸銨溶液與乙腈溶液，0.1%甲酸-1 mm ol/L甲酸銨溶液與乙腈溶液3種流動(dòng)相進(jìn)行分析。結(jié)果表明，0.1%甲酸-1 mm o l/L甲酸銨溶液與乙腈溶液體系的色譜峰尖銳且對(duì)稱(chēng)，保留時(shí)間穩(wěn)定，響應(yīng)值高。通過(guò)繪制有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到了3種有機(jī)酸的線(xiàn)性回歸方程以及線(xiàn)性范圍。有機(jī)酸加樣回收率范圍93.5%～106.07%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值在0.5%～7%之間，說(shuō)明本試驗(yàn)方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確度高、回收率合格，為評(píng)定發(fā)酵乳的特性提供可靠依據(jù)。

[1]JELEN P，GALLMANN P，COOLBEAR T.Current and future applications of fermentation technology in the dairy industry[J].International Dairy Federation Special Issue，2003：10-20.

[2]VALLIC，TRAILLW B.Culture and food：a model of yoghurt consumption in the EU[J].Food Quality and Preference，2005，16（4）：291-304.

[3]LOURENS-HATTINGH A，VILJOEN B C.Yogurt as probiotic carrier food[J].International Dairy Journal，2001，11（1）：1-17.

[4]KENNEY B F.Determination of organic acids in food samples by capillary electrophoresis[J].Journal of Chromatography A，1991，546：423-430.

[5]PERESR G，MORAESE P，M ICKE G A，et al.Rapid method for the determination of organic acids in wine by capillary electrophoresis with indirect UV detection[J].Food Control，2009，20（6）：548-552.

[6]CHINN ICI F，SPINABELLIU，R IPON IC，et al.Optimization of the determination of organic acids and sugars in fruit juices by ion-exclusion liquid chromatography[J].Journal of Food Composition and Analysis，2005，18（2）：121-130.

[7]ALCAZAR A，F(xiàn)ERNANDEZ-CACERESP L，MARTIM J，et al.Ion chromatographic determination of some organic acids，chloride and phosphate in coffee and tea[J].Talanta，2003，61（2）：95-101.

[8]ZEPPA G，CONTERNO L，GERBIV.Determination of organic acids，sugars，diacetyl，and acetoin in cheese by high-performance liquid chromatography[J].Journal of agricultural and food chemistry，2001，49（6）：2722-2726.

[9]SHUIG，LEONG L P.Separation and determination of organic acids and phenolic compounds in fruit juices and drinks by high-performance liquid chromatography[J].Journal of Chromatography A，2002，977（1）：89-96.

[10]KONG Y，ZHANG L L，SUN Y，et al.Determination of the Free Amino Acid，Organic Acid，and Nucleotide in Commercial Vinegars[J].Journal of Food Science，2017，82（5）：1116-1123.

[11]YANG M H，CHOONG Y M.A rapid gas chromatographic method for direct determination of short-chain（C2-C12）volatile organic acids in foods[J].Food Chemistry，2001，75（1）：101-108.

[12]GRAHAM B，MAYOL‐BRACERO O L，GUYON P，et al.Water-soluble organic compounds in biomass burning aerosols over Amazonia 1.Characterization by NMR and GC-MS[J].Journal of Geophysical Research：Atmospheres，2002，107（D20）.

[13]BEINER K，PLEWKA A，HAFERKORN S，et al.Quantification of organic acids in particulate matter by coupling of thermally assisted hydrolysis and methylation with thermodesorption-gas chromatography-mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A，2009，1216（38）：6642-6650.

[14]HUANG Y，TIAN Y，ZHANG Z，et al.A HILIC-MS/MSmethod for the simultaneous determination of seven organic acids in rat urine as biomarkers of exposure to realgar[J].Journal of Chromatography B，2012，905：37-42.

[15]XIANG G，YANG L，ZHANG X，et al.A comparison of three methods of extraction for the determination of polyphenols and organic acids in tobacco by UPLC-MS-MS[J].Chromatographia，2009：70（5-6）：1007-1010.

[16]陳永福，王記成，云振宇，張和平.高效液相色譜法測(cè)定傳統(tǒng)發(fā)酵乳中的有機(jī)酸組成[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2007，（01）：54-58.

[17]劉瑤，張娜，史社坡，宋青青，李軍，宋月林，屠鵬飛.親水作用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定參附注射液中的14種有機(jī)酸[J].中國(guó)中藥雜志，2016，（18）：3342-3348.