韋朝華 俞黎黎 霍江華 錢(qián)炳俊

摘 要：青霉素是臨床使用范圍較廣，效果好且經(jīng)濟(jì)的一種抗生素?；谇嗝顾氐淖饔梦稽c(diǎn)，人們認(rèn)為青霉素對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的效果較好，但同時(shí)臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)革蘭陰性球菌同樣有較好的效果，但對(duì)革蘭陰性桿菌的抗菌效果較差，那么它的殺菌機(jī)理到底如何？本文就目前對(duì)青霉素作用機(jī)制的研究現(xiàn)狀做出分析和探討。

關(guān)鍵詞：青霉素 作用機(jī)制 研究進(jìn)展

中圖分類(lèi)號(hào)：R74 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2018）07（a）-0230-04

自從英國(guó)科學(xué)家Fleming1929年發(fā)現(xiàn)青霉素并用于臨床后[1]。青霉素此后一直在細(xì)菌感染疾病方面的治療有較好的臨床效果和廣泛的臨床應(yīng)用，它的研制使得人類(lèi)進(jìn)入了抗生素時(shí)代，開(kāi)創(chuàng)了用抗生素治療疾病的新紀(jì)元。因?yàn)榧?xì)菌細(xì)胞壁是它的特殊作用位點(diǎn)，使得青霉素如今仍然居于不可替代的地位。青霉素作為β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的一員，能抑制細(xì)胞壁的合成。在低滲環(huán)境下，細(xì)菌會(huì)自發(fā)吸入外界的水分，發(fā)生膨脹，而細(xì)胞壁就好像是高壓鍋的“鎖”，防止細(xì)菌炸裂。一旦細(xì)胞壁發(fā)生缺陷，就好像是高壓鍋突然失去了安全保護(hù)，細(xì)菌自然就會(huì)發(fā)生漲裂，從而死亡。然而人體組織與培養(yǎng)基不一樣。研究人員發(fā)現(xiàn)，在組織中，細(xì)菌往往處于一個(gè)等滲的狀態(tài)。換句話(huà)說(shuō)，即便它們的細(xì)胞壁被破壞了，這些細(xì)菌也不大會(huì)發(fā)生裂解。有意思的是，青霉素等β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素并沒(méi)有對(duì)此束手無(wú)策。相反，這些抗生素能用其他手段防止細(xì)菌增長(zhǎng)，并讓它們死亡。研究人員認(rèn)為，這或許和氧化帶來(lái)的損傷，或是細(xì)胞壁前體通路循環(huán)受阻有關(guān)。當(dāng)前，對(duì)青霉素作用機(jī)制及細(xì)菌的耐藥機(jī)制研究日益豐富，新的細(xì)菌耐藥機(jī)制及新的抗生素作用機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，是指導(dǎo)臨床和非臨床抗生素合理應(yīng)用以及發(fā)現(xiàn)新型抗生素的基礎(chǔ)[2-3]。但β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的作用機(jī)制是一個(gè)多步驟而復(fù)雜的問(wèn)題，對(duì)其殺菌機(jī)制仍是目前研究熱點(diǎn)。

基于青霉素的作用位點(diǎn)認(rèn)為青霉素對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的效果較好，但同時(shí)臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)革蘭陰性球菌同樣有較好的效果，但對(duì)革蘭陰性桿菌的抗菌效果較差，那么它的殺菌機(jī)理到底如何？本文就目前對(duì)青霉素作用機(jī)制的研究現(xiàn)狀做出分析和探討。

1 目前研究近況與分析

近年來(lái)對(duì)青霉素作用機(jī)制的研究工作廣泛深入的開(kāi)展，基于研究的成果，目前分為三個(gè)時(shí)期。

1.1 基于青霉素臨床效果的研究

自發(fā)現(xiàn)青霉素以來(lái)，人們對(duì)其作用機(jī)制研究的第一階段的主要成果歸結(jié)于藥敏實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用的觀察，有3個(gè)重要的早期研究結(jié)果[4]：⑴發(fā)現(xiàn)青霉素對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的作用效果要優(yōu)于革蘭陰性菌；⑵發(fā)現(xiàn)青霉素對(duì)正在增殖的細(xì)菌殺菌效果較好而對(duì)靜止期的細(xì)菌無(wú)效，說(shuō)明其殺菌機(jī)制應(yīng)為在細(xì)菌增殖時(shí)對(duì)其發(fā)生干擾；⑶發(fā)現(xiàn)青霉素能夠誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)的改變，目前解釋為干擾了細(xì)胞壁的代謝破壞了其完整性所致[5]。比格認(rèn)為青霉素殺死了處于分裂期的球 菌，而對(duì)不分裂的個(gè)體則沒(méi)有影響。于是，比格提出間歇性地加入青霉素，希望這些“頑固者”能在加藥間歇期開(kāi)始分裂從而被下一劑青霉素殺死。研究發(fā)現(xiàn)在低濃度的青霉素中，球菌膨脹到正常體積的三倍而不分裂，桿菌也表現(xiàn)出類(lèi)似的變化。托德在關(guān)于青霉素溶菌作用實(shí)驗(yàn)的報(bào)道中也引用了這一研究和其他研究結(jié)果。在用I型、II型和III型肺炎雙球菌、綠色鏈球菌、溶血鏈球菌、葡萄球菌和韋氏梭菌進(jìn)行的研究中，他發(fā)現(xiàn)所用的這些菌株都被青霉素溶解了，然而像大腸桿菌和綠膿桿菌等對(duì)青霉素具有抗性的細(xì)菌則不被溶解。但是他認(rèn)為青霉素不通過(guò)溶菌作用也能殺死細(xì)菌。當(dāng)溶菌發(fā)生時(shí)，其速率取決于細(xì)菌增殖的實(shí)際速率或潛在速率?！翱磥?lái)抑菌、殺菌和溶菌可能是同一過(guò)程中依次進(jìn)行的不同階段?！弊羁斓娜芫俣瘸霈F(xiàn)在增殖速率最大的細(xì)菌中。這也許就是青霉素如此有效的真正原因，也就是說(shuō)，培養(yǎng)時(shí)間不長(zhǎng)的增殖活躍的細(xì)菌更易受到溶菌作用影響，雖然這時(shí)細(xì)菌最容易侵入人體，但是同時(shí)也最容易被溶解。

1.2 基于細(xì)菌的形態(tài)學(xué)研究

第二階段的主要研究成果是隨著對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁組成成分的了解而取得的。革蘭陽(yáng)性細(xì)胞壁由肽聚糖和胞壁酸構(gòu)成，革蘭陰性菌細(xì)胞壁由肽聚糖和外膜構(gòu)成。革蘭陽(yáng)性菌的肽聚糖由聚糖支架、四肽側(cè)鏈和五肽交聯(lián)橋三部分組成，革蘭陰性菌肽聚糖由聚糖支架和四肽側(cè)鏈兩部分組成。聚糖支架由N-乙酰葡萄糖胺（N-acetyl glucosamine）和N-乙酰胞壁酸（N-acetylmuramic acid）交替間隔排列，以β-1，4糖苷鍵連接而成；每個(gè)胞壁酸分子上連接一條四肽側(cè)鏈，革蘭陽(yáng)性菌四肽側(cè)鏈通過(guò)五肽交聯(lián)橋相互連接，構(gòu)成堅(jiān)韌的三維立體框架結(jié)構(gòu)。與革蘭陽(yáng)性細(xì)菌不同的是，革蘭陰性菌的四肽側(cè)鏈與相鄰四肽側(cè)鏈直接連接，缺少五肽交連橋，形成較疏松的二維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

1965年Strominger等[6]在這階段做出了重要貢獻(xiàn)，提出D-丙氨酰-D-丙氨酸立體構(gòu)型酷似青霉素（見(jiàn)圖1），青霉素的作用機(jī)制可能是抑制了黏肽交聯(lián)過(guò)程中轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，轉(zhuǎn)肽酶因而誤認(rèn)青霉素為其底物，因?yàn)榍嗝顾胤肿优c乙酰-D-Ala-Ala的分子結(jié)構(gòu)類(lèi)似，競(jìng)爭(zhēng)性地與酶的活性中心結(jié)合，當(dāng)酶和青霉素通過(guò)?；磻?yīng)被不可逆地交聯(lián)在一起時(shí)（見(jiàn)圖2），酶即失活，致使細(xì)菌細(xì)胞壁合成中的交聯(lián)反應(yīng)中斷，從而阻止細(xì)胞壁肽聚糖交聯(lián)的形成，細(xì)菌由于細(xì)胞壁的破壞而死亡[7]。所以在早期研究青霉素作用中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)金黃色葡萄球菌在節(jié)基青霉素存在下培養(yǎng)，其細(xì)胞壁含有的D-丙氨酸比正常情況下多，這可能就是轉(zhuǎn)肽酶與青霉素結(jié)合引起的結(jié)果[8]。

青霉素能自由通過(guò)革蘭陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁，而青霉素只有通過(guò)革蘭陰性菌的細(xì)胞壁一是通過(guò)直接在膜的類(lèi)脂相擴(kuò)散，二是外膜上的膜孔道蛋白進(jìn)入，是進(jìn)入革蘭陰性菌的主要途徑。青霉素作為治療革蘭陰性球菌尤其是奈瑟菌屬的首選藥，作用在交聯(lián)反應(yīng)中競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合相鄰的氨基上，從而使細(xì)菌細(xì)胞壁合成障礙繼而死亡，但究其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，革蘭陰性菌沒(méi)有五肽交聯(lián)橋，不參與肽聚糖的交聯(lián)反應(yīng)，那么青霉素對(duì)革蘭陰性球菌如淋病奈瑟菌的作用機(jī)制是如何呢，是否其作用不僅僅是與轉(zhuǎn)肽酶結(jié)合還有可能在四肽側(cè)鏈丙氨酸的合成上，而且實(shí)驗(yàn)證明青霉素對(duì)大腸埃希菌的作用效果不好。但與此同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生其他猜想-青霉素對(duì)革蘭陰性球菌仍然有較好的效果，是不是球菌與桿菌的形態(tài)學(xué)差異導(dǎo)致其不同耐藥性的不同，所以理解它們的細(xì)胞壁的合成過(guò)程是至關(guān)重要的。這種認(rèn)識(shí)不僅在細(xì)胞形成和分裂的環(huán)境中很重要，而且在目前抗生素耐藥性的大環(huán)境中也很重要，因?yàn)榧?xì)胞壁合成是β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的靶標(biāo)，對(duì)細(xì)菌形態(tài)形成的有價(jià)值的認(rèn)識(shí)表明，對(duì)形態(tài)學(xué)上不同的生物體進(jìn)行比較研究，包括臨床相關(guān)的病原體，以更好理解細(xì)菌的生長(zhǎng)與分裂，而這些需進(jìn)一步研究驗(yàn)證[9]。

細(xì)菌的形狀是由細(xì)胞壁決定的，并且可以是非常多樣化的。即使是在球菌的屬中，也有不同的形狀存在。例如，葡萄球菌或奈瑟菌細(xì)胞是真正的圓型，鏈球菌，乳酸球菌，或腸球菌都有卵形。有趣的是，有機(jī)體的形狀與它的一組青霉素結(jié)合蛋白之間似乎存在著某種聯(lián)系，這種酶是細(xì)胞壁的主要組成部分——肽聚糖。雖然只有一個(gè)肽聚糖生物合成機(jī)械似乎存在于葡萄球菌中，但其中兩種機(jī)械被提議在卵形細(xì)菌中發(fā)揮作用，從而加強(qiáng)了不同種類(lèi)的球菌的形態(tài)發(fā)生的內(nèi)在差異。

1.3 基于靶向分子學(xué)的研究

基于細(xì)菌細(xì)胞壁可以選擇性透過(guò)青霉素的基礎(chǔ)上，青霉素作用機(jī)制研究的第三階段，其主要研究結(jié)果是闡明了青霉素的作用位點(diǎn)是青霉素結(jié)合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs），研究表明細(xì)菌的細(xì)胞膜上有特殊的蛋白分子，能與青霉素或頭孢菌素類(lèi)相結(jié)合，稱(chēng)為“青霉素結(jié)合蛋白（PBP）”。1972年，Suginaka[10]等通過(guò)放射性同位素標(biāo)記青霉素的方法檢測(cè)到細(xì)菌表面的PBP，它具有糖基轉(zhuǎn)移酶、肽基轉(zhuǎn)移酶和羧肽酶活性。青霉素的β-內(nèi)酰胺環(huán)與細(xì)菌D-丙氨酰-D-丙氨酸末端具有相似的結(jié)構(gòu)，能與 D-丙氨酰-D-丙氨酸競(jìng)爭(zhēng) PBPs的活性位點(diǎn)。并且，相比于 D-丙氨酰-D-丙氨酸，β-內(nèi)酰胺環(huán)與PBPs的親和性更高。β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素通過(guò)β-內(nèi)酰胺環(huán)中的羧基和細(xì)菌相應(yīng) PBPs 結(jié)合，從而有效控制生物學(xué)功能，致使網(wǎng)狀細(xì)胞壁無(wú)法形成，還可引起細(xì)菌形態(tài)改變，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞死亡，以此發(fā)揮殺菌作用（見(jiàn)圖3）[11]。

研究發(fā)現(xiàn)青霉素與不同細(xì)菌青霉素結(jié)合蛋白結(jié)合引起了細(xì)菌形態(tài)學(xué)改變。一種是與PBP2特異性結(jié)合的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，能夠使細(xì)菌的形態(tài)變成卵形；第二種是與PBP3優(yōu)先結(jié)合的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，能夠特異性地抑制細(xì)菌細(xì)胞的分裂；第三種是與PBP1優(yōu)先結(jié)合的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，抑制細(xì)胞的延生并引起細(xì)胞的裂解。在沒(méi)有PBP1的細(xì)菌中，青霉素與PBP2和PBP3結(jié)合后，能夠看到細(xì)菌細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)“鼓脹”現(xiàn)象。例如：對(duì)革蘭陰性的腦膜炎雙球菌，青霉素主要與其膜上PBP1與PBP2結(jié)合后，引起細(xì)菌形態(tài)的變化，形成絲狀體和球形體，中隔膨脹等，最后導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)停止，通過(guò)細(xì)菌直溶酶使細(xì)菌溶解死亡。淋病奈瑟菌可用青霉素治療也是同樣的道理。但是青霉素并不是對(duì)所有的革蘭陰性菌都有作用，例如一些革蘭陰性桿菌布魯菌屬、假單胞菌屬、大腸埃希菌屬等對(duì)其均耐藥，可能由于這些菌缺少PBP[12]。與此同時(shí)，發(fā)現(xiàn)革蘭陰性菌的外膜對(duì)不易透過(guò)青霉素，從而引發(fā)猜想是否與其通透方式或通透性有關(guān)。在細(xì)菌中，PBPs的數(shù)量有很大的不同，而rod型的大腸桿菌有12個(gè)，而球菌的數(shù)量則更少，通常從4個(gè)到7個(gè)PBPs。這些數(shù)字最初是由在凝膠電泳前用放射性標(biāo)記的青霉素培養(yǎng)的細(xì)胞或膜來(lái)確定的。所以說(shuō)PBPS的不一樣很有可能是最終原因。

2 結(jié)語(yǔ)

不過(guò)，在經(jīng)歷了青霉素洗禮、已經(jīng)奄奄一息的細(xì)菌進(jìn)一步遇到溶菌酶時(shí)，居然會(huì)發(fā)生意想不到的改變——在溶菌酶的作用下，這些細(xì)菌索性脫去了細(xì)胞壁，搖身一變，進(jìn)入了一種叫做“L-form”的形態(tài)。紐卡斯?fàn)柎髮W(xué)的這支團(tuán)隊(duì)對(duì)L-form形態(tài)的細(xì)菌有過(guò)報(bào)道。此類(lèi)細(xì)菌沒(méi)有細(xì)胞壁，因此青霉素或溶菌酶等通過(guò)破壞細(xì)胞壁來(lái)殺菌的方法對(duì)其不起作用。而有著此類(lèi)形態(tài)的細(xì)菌在人體組織的保護(hù)下，還能夠正常生長(zhǎng)。研究人員們指出，這也是許多感染復(fù)發(fā)的潛在原因之一?；A(chǔ)理論的研究，能推動(dòng)科學(xué)以更快的速度向前發(fā)展，β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素抗菌作用機(jī)理的研究，正是在廣泛推行這類(lèi)抗生素的結(jié)構(gòu)改造迫切需要理論指導(dǎo)的歷史背景下開(kāi)展起來(lái)的，盡管β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的結(jié)構(gòu)改造已經(jīng)取得了重要的成就，但這些成就是在驚人龐大的工作規(guī)模下取得的，因?yàn)槿鄙僬_的理論指導(dǎo)，在化合物設(shè)計(jì)中很難避免大量存在的盲目性。所以，當(dāng)Strominger等在1965年提出β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的作用機(jī)制后，不僅很快吸引了更多的人，從各個(gè)方面投入這個(gè)基礎(chǔ)理論研究，而且使世界β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的結(jié)構(gòu)改造，出現(xiàn)了逐漸轉(zhuǎn)向圍繞這個(gè)作用機(jī)制進(jìn)行設(shè)計(jì)研究的趨勢(shì)。就本文對(duì)一些問(wèn)題的思考，希望對(duì)未來(lái)青霉素作用機(jī)制的研究提供思路，為開(kāi)發(fā)更有效的抗菌藥物提供參考。

參考文獻(xiàn)

[1] 李在威，楊頻.青霉素結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)、功能與β-內(nèi)酰胺抗生素的作用機(jī)理研究進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1986（4）：24-29.

[2] Ioerger TR， O'Malley T， Liao R， et al. Identification of new drug targets and resistance mechanisms in Mycobacterium tuberculosis[J].Plos One，2013， 8（9）：75245.

[3] Wright GD. Q&A;： Antibiotic resistance： where does it come from and what can we do about it？[J]. BMC Biol. 2010，8（1）：1-6.

[4] 張韜，倪孟祥，邵雷，等.β-內(nèi)酰胺抗生素作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國(guó)抗生素雜志，2015，40（10）：785-790.

[5] Bush K， Pucci MJ. New antimicrobial agents on the horizon[J]. Biochemical Pharmacology， 2011， 82（11）：1528-1539.

[6] Tipper DJ， Strominger JL. Mechanism of action of penicillins： a proposal based on their structural similarity to acyl-D-alanyl-D-alanine[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1965， 54（4）：1133-1141.

[7] Jr WE， Park JT. Penicillin： its basic site of action as an inhibitor of a peptide cross-linking reaction in cell wall mucopeptide synthesis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1965，54（1）：75-81.

[8] 周惠殊.β—內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的結(jié)構(gòu)改造及構(gòu)效關(guān)系的探討[J].國(guó)外醫(yī)藥抗生素分冊(cè)，1980（1）：1-22.

[9] Suginaka H， Blumberg PM， Strominger JL. Multiple penicillin-binding components in Bacillus subtilis， Bacillus cereus， Staphylococcus aureus， and Escherichia coli[J]. Journal of Biological Chemistry， 1972， 247（17）：5279.

[10]Guignard B， Entenza JM， Moreillon P. β-lactams against methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J]. Current Opinion in Pharmacology， 2005，5（5）：479-489.

[11]Spratt BG. Distinct Penicillin Binding Proteins Involved in the Division， Elongation， and Shape of Escherichia coli K12[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1975， 72（8）：2999-3003.