李學梅，吳興兵，王旭歌，朱永久，楊德國

(中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部淡水生物多樣性保護重點實驗室，武漢 430223)

應激的監(jiān)測不僅在于判斷應激發(fā)生與否及應激程度，還在于判斷魚體的敏感性，對改善魚類養(yǎng)殖管理，提高養(yǎng)殖效益具有重要意義。目前，長鰭吻的研究主要集中在資源量調(diào)查、種群生態(tài)學、生物學及人工繁殖技術等[1，5-7]。關于長鰭吻應激監(jiān)測方面的研究尚未見報道。本研究以常見應激因子HSP70 (熱休克蛋白)、特異性免疫因子IgM(免疫球蛋白)、抑炎性因子IL-10(白細胞介素10)和促炎性因子IL-1b(白細胞介素1)為監(jiān)測對象，初探感染和未感染小瓜蟲的長鰭吻皮膚和腸道組織中這些免疫因子的表達差異，旨在為長鰭吻應激監(jiān)測方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

表1 不同處理組長鰭吻體長體重(平均值±標準差) Tab.1 The body length and body weight of R.ventralis in different group (Mean±SD)

1.2 引物合成

在GeneBank 數(shù)據(jù)庫中下載鯉(Cyprinuscarpio)、斑馬魚(Daniorerio)、草魚(Ctenopharyngodonidella)、鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、鯽(Carassiusauratus)的HSP70、IgM、IL-10和 IL-1b基因的cDNA核苷酸序列，通過Clustal X2比對分析保守區(qū)，應用 Primer Premier 5.0 軟件，按照引物設計的基本要求，設計并合成4對引物(表2)，用于擴增長鰭吻HSP70、IgM、IL-10和 IL-1b基因的保守片段。根據(jù)獲得的保守片段，設計出HSP70-S/HSP70-A、IgM-S/IgM-A、IL10-S/IL10-A和IL1b-S/IL1b-A等 4對熒光定量表達的基因特異性引物，用實驗室已有的四川裂腹魚的βactin-S/βactin-A為熒光定量表達的內(nèi)參引物(表3)。因目前長鰭吻相關的內(nèi)參基因尚未有報道，因此選擇與吻屬同源性較高的已有報道的裂腹魚屬(同源性99%)βactin基因作為內(nèi)參進行初探，且對該內(nèi)參進行了預實驗分析。上述引物均由武漢天一輝遠生物科技有限公司設計和合成。

表2 長鰭吻不同免疫因子保守序列擴增所用引物Tab.2 Amplification primers of different cytokine gene in R.ventralis

表3 長鰭吻不同免疫因子基因定量PCR擴增所用引物Tab.3 Quantitative PCR amplification primers of different cytokine genes in R.ventralis

1.3 DNA提取與克隆

以所合成的cDNA為模板，以HSP70-S/HSP70-A、IgM-S/IgM-A、IL10-S/IL10-A、IL1b-S/IL1b-A和βactin-S/βactin-A為引物進行PCR擴增。20 μL PCR 反應體系：滅菌的雙蒸水 6.0 μL、2× qPCR Mix (SYBR? Select Master Mix，ABI)10.0 μL、2.5 μmol/L基因正反引物各1.0 μL、cDNA 2.0 μL。PCR 反應條件：95 ℃預變性 10 min；95 ℃ 15 s，59 ℃/60 ℃ 1 min，40個循環(huán)，60 ℃延伸5 min。在60 ℃→95 ℃過程中，每升溫0.3 ℃檢測一次，形成溶解曲線。反應產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)Gel DocTMXR+凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad，美國)分析圖像。結(jié)果以相同起始量的β-actin 進行校正，并以4個特異基因和β-actin 電泳帶相對吸光度的比值來表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用 IBM SPSS statistics 22 軟件進行Student's t-test統(tǒng)計分析與顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 HSP70、IgM、IL-10和 IL-1b基因序列分析

通過優(yōu)化PCR 擴增的條件，獲得HSP70、IgM、IL-10和IL-1b基因的特異擴增產(chǎn)物，經(jīng)回收和測序后得到長度分別為412 bp、463 bp、520 bp和217 bp的部分cDNA序列(圖1)，獲得GenBank登陸號為KY696266- KY696269。

與GeneBank中已有的魚類序列進行比較，本研究中長鰭吻HSP70、IgM、IL-10和 IL-1b基因序列與圓口銅魚(CoreiusguichenotiKF471123.1)、草魚(HM452137.1)、鰱(DQ058296.1)、圓筒吻(R.cylindricusKF724884.1)的同源性依次為99%、87%、96%和97%。

2.2 長鰭吻HSP70、IgM、IL-10和IL-1b基因組織表達差異

利用定量PCR方法檢測得到HSP70、IgM、IL-10和 IL-1b基因在感染小瓜蟲組和對照組長鰭吻皮膚和腸道組織的表達差異，并以上述4個基因與β-actin電泳帶吸光度的比值繪制了他們在長鰭吻皮膚和腸道組織中表達的相對豐度(圖2)。由圖 2可知，在皮膚組織中，IgM和IL-10在感染小瓜蟲魚體中表達量顯著高于對照魚(P<0.05)，HSP70和IL-1b的表達則沒有差異；在腸道組織中，IgM、IL-10和 IL-1b在感染魚體中表達量顯著增高(P<0.05)，HSP70的表達量在感染魚體和對照魚體中則沒有差異。

3 討論

HSP70作為一種應激蛋白，其家族分子在幫助機體細胞應對各種不利環(huán)境中起關鍵作用，它通常作為危險信號以提高機體適應熱的能力及對抗多種壓力刺激，進而幫助生物體迅速適應環(huán)境變化以抵御外界不良損害[9-11]。本研究中通過分析發(fā)現(xiàn)，HSP70不論是在皮膚組織還是腸道組織中，在感染小瓜蟲和對照組長鰭吻中表達量都沒有顯著差異(圖2)。說明本研究中因應激刺激而感染小瓜蟲后的長鰭吻在皮膚和腸道組織中并沒有誘導出HSP70蛋白的合成。趙建華在研究圓口銅魚的急性操作脅迫和長途運輸脅迫的應激反應中發(fā)現(xiàn)，HSP70在魚鰭的表達量最低[12]。但林亞秋等[13]研究表明，熱刺激后草魚魚鰭中HSP 70的表達量最高，這可能是因為魚類種類不同，熱應激因子

IgM作為魚類的先天性免疫因子，是魚體的天然抗體，存在于魚類的血清、組織液、腸道、皮膚和鰓的粘液中[14]。本研究中，IgM在感染組長鰭吻中的皮膚和腸道中的表達量均顯著提高(圖2，P<0.05)。說明在長期吻的免疫應答系統(tǒng)中，抗體應答作用顯著。

與哺乳類相比，魚類的特異免疫系統(tǒng)尚不夠發(fā)達，在魚類對外界刺激及病原生物侵襲的防御反應中，非特異性免疫起著重要作用，魚類非特異性免疫細胞和體液免疫因子包括溶菌酶、干擾素、補體、白細胞介素、鐵傳遞蛋白、抗菌肽等[15]。IL-10是一種抑炎性細胞因子，主要功能是調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應，從而最大限度地減少因病原體或自身免疫系統(tǒng)對宿主的損害[16]。本研究中，IL-10在感染組長鰭吻的皮膚和腸道組織中均顯著提高(圖2，P<0.05)，說明IL-10在長鰭吻免疫應答反應中較為敏感。相比較，IL-1b作為典型的促炎性細胞因子，僅在感染組長鰭吻的腸道組織中顯著提高(圖2，P<0.05)，盡管有報道稱小瓜蟲感染的鯉魚皮膚中IL-1b表達水平遠高于血液中的表達，在36 h達到峰值[17]。上述結(jié)果表示在本研究中，相對于非特異性免疫因子IL-1b，IL-10在長鰭吻免疫應答反應中更敏感。

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