封 琦，朱光來，王建國，齊富剛，熊良偉，王 權(quán)

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院水產(chǎn)科技學(xué)院，江蘇泰州 225300)

中華鳑鲏(Rhodeussinensis)是鯉形目鯉科鳑鲏屬的一種小型底棲型魚類，不僅具有很高的觀賞價值，而且在養(yǎng)殖實踐中還可用作“生態(tài)魚”，對水體環(huán)境起到指示預(yù)警作用[1]。氨氮作為養(yǎng)殖水體中重要的環(huán)境因子，一直是水質(zhì)監(jiān)測的重要指標(biāo)之一。氨氮主要來自于水體中的外源有機物分解以及水生動物自身的內(nèi)源排泄物[2]。氨氮不僅會對魚類的鰓表皮細(xì)胞造成損害，從而影響呼吸作用；還會對肝腎組織造成破壞，并導(dǎo)致非特異性免疫抑制效應(yīng)[3-4]。目前有關(guān)氨氮對魚類作用的研究主要集中在兩方面，一方面?zhèn)戎赜趶沫h(huán)境污染評估角度尋找分子標(biāo)記物[3,5]；另一方面則從免疫、代謝角度研究氨氮毒性作用機理[6-8]。研究對象則主要以斑馬魚等模式生物以及主要養(yǎng)殖商品魚類為主[4-5,9-15]。氨氮對中華鳑鲏的作用影響則未見相關(guān)報道。已有研究表明氨氮長期暴露會對魚類的免疫能力，抗應(yīng)激能力造成抑制作用[16-17]。堿性磷酸酶(Alkalinephosphates，AKP)是一種常見的免疫標(biāo)志酶[18]。李波等[19]發(fā)現(xiàn)在慢性氨氮脅迫下，黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)血液中AKP酶活性升高較快。過氧化氫酶(Catalyse，CAT)是生物抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，在生物毒性評價中有重要意義。Sinha等[20]認(rèn)為常見鯉科魚類(錦鯉Cyprinuscarpio和金魚Carassiusauratus)在遇到氨氮刺激時，肝臟中的CAT將組成抗氧化應(yīng)激的首道防線，對機體起保護(hù)作用。本研究以氯化銨模擬水體中氨氮，研究了氨氮對中華鳑鲏急性毒性，并根據(jù)急性毒性結(jié)果進(jìn)一步探明了氨氮脅迫下中華鳑鲏血清中過氧化氫酶(CAT)和堿性磷酸酶(AKP)的響應(yīng)變化，為中華鳑鲏健康養(yǎng)殖中的水質(zhì)管理提供科學(xué)建議。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

中華鳑鲏購自江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院啟航水族店，試驗前在1.0 m×0.6 m×0.5 m的水族缸中暫養(yǎng)兩周。暫養(yǎng)期間，正常投喂配合飼料，每天清除排泄物，水溫維持在(25±1)℃，pH為7.4±0.1。挑選健康、活潑的個體(體重(0.628±0.006)g，體長(3.989±0.290)cm用于試驗。

測定酶活性所用的試劑盒(CAT、AKP)均購自南京建成生物科技有限公司,NH4Cl及其他藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗設(shè)計

急性毒性試驗采用靜水法，根據(jù)預(yù)實驗，設(shè)置6個濃度組200、230、260、290、320、360 mg/L和1個空白對照，每組3個平行。不同濃度的測試液采用0.01 mol/L磷酸緩沖液(維持pH 7.4左右)添加適量NH4Cl制備成，每組水量10 L。每個濃度組隨機加入20尾活力良好的中華鳑鲏，24 h后計數(shù)死亡個體數(shù)。

在急性毒性試驗的基礎(chǔ)上，按1/10、1/20、1/30 LC50設(shè)置高、中、低3個處理組，每組處理3個平行；每個處理組20條魚，其余試驗條件同急性毒性測試；分別于0、24、48、72 h隨機取出5尾，采用1 mL無菌注射器圍心腔取血，合并置于無菌離心管中，3 500 r/min離心10 min，取上層血清，立即測定CAT、AKP酶活性，測定方法參照試劑盒說明書。

1.3 數(shù)據(jù)分析

急性毒性數(shù)據(jù)采用概率單位法分析，為檢驗氨氮高、中、低濃度對CAT和SOD酶活性的時間變化影響，采用雙因素方差(two-way ANOVA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析(固定因子為氨氮濃度和暴露時間)。方差分析之前,檢驗樣本數(shù)據(jù)是否滿足正態(tài)性(Shpiro-Wilk)及方差齊性(Levene’s test)。如果數(shù)據(jù)方差不齊,則進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換使之滿足方差齊性。交互作用顯著時,通過MANOVA語句分別檢驗氨氮濃度或暴露時間處理在另一因素不同水平上的簡單效應(yīng)[21-22]；交互作用不顯著時，分析氨氮濃度和暴露時間的主效應(yīng)，并采用Bonferroni法進(jìn)行事后多重比較，所有計算均采用統(tǒng)計軟件SPSS 24.0完成。

2 結(jié)果

2.1 氨氮對中華鳑鲏的急性毒性作用

中華鳑鲏放入測試液中不久，就觀察到高濃度組320、360 mg/L中出現(xiàn)上浮現(xiàn)象，3 h后魚體失去平衡，12 h后出現(xiàn)體表充血、死亡現(xiàn)象，急性毒性實驗結(jié)果見表1。采用概率單位法計算得到氨氮對中華鳑鲏24 h LC50(95%置信區(qū)間)為263.28 mg/L(200.97～344.93 mg/L)；毒力回歸方程為：y=-24.404 4+12.148 5x，r=0.945 2。

表1 氨氮對中華鳑鲏的急性毒性效應(yīng)

2.2 氨氮對中華鳑鲏血清CAT活性的影響

由表2可知，高中低三個劑量組中CAT酶活性均隨著暴露時間延長呈現(xiàn)下降趨勢，由圖1可見，每個時間點的CAT酶活性隨著氨氮劑量增高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。雙因素方差分析表明：氨氮濃度和暴露時間均會對CAT酶活性造成顯著影響，其中暴露時間對CAT酶活性影響作用極顯著，并且兩因素之間存在顯著的交互作用(見表3)。簡單效應(yīng)檢驗結(jié)果顯示暴露時間對CAT酶活性的作用受到不同氨氮濃度的影響(MANOVA,9 mg/L:F3,26=15.06，P<0.01；13 mg/L，F(xiàn)3,26=12.23，P<0.01；26 mg/L，F(xiàn)3,26=30.08，P<0.01)。

圖1 氨氮濃度對中華鳑鲏血清CAT酶活性的作用影響

表2 不同暴露時間對中華鳑鲏血清CAT酶活性的影響

表3 氨氮和暴露時間對中華鳑鲏血清CAT酶活性的雙因素方差分析

注：加粗?jǐn)?shù)字表明差異顯著P<0.05。表5同。

2.3 氨氮對中華鳑鲏血清AKP酶活性的影響

由表4可知，低劑量組中AKP酶活性均隨著暴露時間延長呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，在中、高劑量組則呈現(xiàn)隨時間下降趨勢。由圖2可見，每個時間點的AKP酶活性隨著氨氮劑量增高呈現(xiàn)下降的趨勢。雙因素方差分析表明：氨氮濃度和暴露時間均會對AKP酶活性影響極顯著，并且兩因素之間存在極顯著的交互作用(見表5)。MANOVA檢驗結(jié)果顯示氨氮濃度在暴露時間24 h和48 h兩個水平上簡單效應(yīng)極顯著(24 h:F3,27=7.80，P<0.01；48 h，F(xiàn)3,27=15.24，P<0.01)；暴露時間在氨氮濃度9 mg/L水平上簡單效應(yīng)極顯著(F3,26=9.42，P<0.01)。

圖2 氨氮濃度對中華鳑鲏血清AKP酶活性的作用影響

表4不同暴露時間對中華鳑鲏血清AKP酶活性的影響

Tab.4EffectsofexposuretimeonactivityofAKPinserumofR.sinensis(x±s,n=3)

金氏單位/100 mL

表5 氨氮和暴露時間對中華鳑鲏血清AKP酶活性的雙因素方差分析

3 討論

3.1 氨氮對中華鳑鲏的急性毒性

氨氮普遍存在于水體環(huán)境中，其主要來源于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廢水排放以及生物廢棄物降解。氨氮對所有脊椎動物均有毒性作用，會造成痙攣、昏迷以及死亡等癥狀[23]。水環(huán)境中高濃度的氨氮會對魚類產(chǎn)生氧化應(yīng)激作用，造成肝組織病理變化及細(xì)胞凋亡[24]；還會對紅細(xì)胞產(chǎn)生明顯的遺傳毒性作用[6]。

本研究發(fā)現(xiàn)在水溫25 ℃，pH 7.4的條件下，中華鳑鲏對氨氮有較強的耐受性。氨氮對中華鳑鲏的24 h LC50(263.28 mg/L)要高于此前報道的斑馬魚(126 mg/L)[25]、青魚幼魚(Mylopharyngodonpiceus)(80.98 mg/L)[13]、團(tuán)頭魴幼魚(Megalobramaamblycephala)(65.277 mg/L)[4]、白斑狗魚幼魚(Esoxlucius)(34.36 mg/L)[9]以及鱖(Megalobramaamblycepha(a))(35.51 mg/L)[26]。氨氮對水生生物的毒性主要受到水體溫度、pH、離子強度的影響；尤其pH對其毒性效應(yīng)影響顯著(酸性時毒性降低，堿性時毒性變強)。本試驗所采用的溫度和pH條件參考了此前研究報道，排除了主要外在因素的干擾，試驗結(jié)果具有一定的可比性。研究表明魚類可以采用某些生理代謝機制，保護(hù)自身免受外界環(huán)境中的氨氮刺激：有許多硬骨魚類在高濃度氨氮環(huán)境中，腦部能夠主動激活谷氨酰胺合成，再釋放到血液中，作為無毒載體將氨氮從不同組織運送到肝臟中進(jìn)行代謝[27-28]；還有有些魚類在受到氨氮脅迫時，可以通過降低蛋白以及氨基酸水解速率以減緩氨氮產(chǎn)生，從而降低氨氮毒性[23]。王建國等[29]研究發(fā)現(xiàn)中華鳑鲏的排氨率遠(yuǎn)低于沙塘鱧等魚，因此中華鳑鲏可能主要依靠上述機制來減少氨氮毒性。此外Clifford等[30-31]以一種深海“清道夫”—太平洋八目鰻(Eptatretusstoutii)為研究對象，對其氨氮耐受性進(jìn)行了研究，他們認(rèn)為魚類中普遍存在的一類NH4+轉(zhuǎn)運蛋白Rhesus (Rh)糖蛋白在氨氮排泄中起著十分重要的作用。中華鳑鲏生活在水體中下層、能攝食腐肉等生態(tài)特征與太平洋八目鰻等高氨氮耐受性魚類相近，因此中華鳑鲏也可能存在相似生理機制來抵御氨氮刺激。

3.2 統(tǒng)計方法比較

此前的報道中多采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和多重比較的方法對不同濃度組和時間點的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，均發(fā)現(xiàn)時間對氨氮毒性有一定影響，但并未對暴露時間和濃度的交互作用進(jìn)行驗證[5,19,32-34]。本研究中采用雙因素方差分析方法，對兩者的交互作用進(jìn)行了詳細(xì)檢驗，發(fā)現(xiàn)暴露時間和濃度對CAT和AKP的酶活性均存在交互作用；并且采用MANOVA語句對各因子不同水平上的簡單效應(yīng)進(jìn)行了分析，規(guī)避了此前的統(tǒng)計分析漏洞。

3.3 氨氮對CAT酶活性的作用

已有報道表明養(yǎng)殖水體中的氨氮會對魚類的血清抗氧化系統(tǒng)造成損害[35]。CAT作為魚體中一類重要的抗氧化酶類，常被用作生物標(biāo)志物，可用來預(yù)測環(huán)境中的氨氮污染[25,32,36]。本研究發(fā)現(xiàn)在氨氮脅迫下，CAT酶活性隨著暴露時間延長總體呈下降趨勢，并且在同一時間點會隨著氨氮劑量增高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；該現(xiàn)象與韓力強[37]、許星鴻等[25]的觀察結(jié)果一致。這說明氨氮對CAT具有抑制作用；在低濃度范圍內(nèi)隨著氨氮濃度增加，CAT酶活性隨之增加以維持體內(nèi)氧化還原平衡，當(dāng)氨氮超過一定濃度范圍后，將對機體造成損傷，從而導(dǎo)致酶活性下降。此外，統(tǒng)計分析結(jié)果表明CAT酶活性受到濃度和暴露時間二者的顯著影響，這說明氨氮對中華鳑鲏的毒性效應(yīng)與濃度和暴露時間密切相關(guān)，與其余報道的研究結(jié)論相一致[6,10,14]。

3.4 氨氮對AKP酶活性的影響

AKP是一種參與磷代謝的水解酶，常被用作免疫學(xué)指標(biāo)監(jiān)測環(huán)境污染[38-40]。艾春香等[41]研究發(fā)現(xiàn)擬穴青蟹AKP對氨氮脅迫比較敏感。在氨氮脅迫初始階段，低劑量組中AKP酶活性呈上升趨勢，而在中高濃度組呈下降趨勢。這說明在低濃度氨氮脅迫下，機體能夠主動產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)以提高AKP酶活性；當(dāng)氨氮濃度高于9 mg/L時，將超過機體調(diào)節(jié)范圍，并對AKP產(chǎn)生抑制作用。另外，隨著暴露時間延長，AKP最終呈下降趨勢，這說明隨著暴露時間延長氨氮會對AKP酶活性產(chǎn)生抑制作用，破壞魚體免疫力，從而引起病害發(fā)生。

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