陳家明，馬詩(shī)經(jīng)，焦春偉，張命龍，陳天洪，謝意珍，2**，李崇，2，李良秋，2，楊偉君

（1.廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣東廣州510663；2.廣東省微生物研究所，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510070）

冬蟲(chóng)夏草[Ophiocordyceps sinensis(Berk.)G.H.Sung et al.]是珍貴的蟲(chóng)生真菌[1]，具有良好的補(bǔ)肺益腎、抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、調(diào)節(jié)免疫[4]、抗衰老、降血糖等功效[5]。但存在野生資源匱乏，人工培育尚存技術(shù)困難等問(wèn)題。加之過(guò)度采挖，目前野生的冬蟲(chóng)夏草已處于瀕危狀態(tài)[6]。中國(guó)被毛孢（Hirsutella sinensis）已被證實(shí)為冬蟲(chóng)夏草的無(wú)性型[7-8]，含有核苷、多糖和甾醇等與冬蟲(chóng)夏草類(lèi)似的有效成分，具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等作用[9]，成為冬蟲(chóng)夏草最佳的替代品。目前，國(guó)內(nèi)中國(guó)被毛孢以液體發(fā)酵為主，但液體發(fā)酵對(duì)設(shè)備要求高、工藝較復(fù)雜、成本高以及發(fā)酵過(guò)程易污染。而固體發(fā)酵具有原料低廉，設(shè)備和工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，部分研究者對(duì)中國(guó)被毛孢進(jìn)行固體發(fā)酵研究，并取得一定的成果。

研究表明，添加不同類(lèi)型的碳源、氮源對(duì)中國(guó)被毛孢發(fā)酵過(guò)程的生物量和生長(zhǎng)情況影響較大[10-11]，其中以葡萄糖、蔗糖為碳源，蠶蛹粉、酵母粉、蛋白胨等較有利于中國(guó)被毛孢的生長(zhǎng)[12]。目前，文獻(xiàn)報(bào)道以菌絲體生物量為指標(biāo)，對(duì)中國(guó)被毛孢固體、液體發(fā)酵工藝、參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化研究為主[13]，以功能成分如麥角甾醇[14]、核苷類(lèi)物質(zhì)[15]等作為指標(biāo)的研究相對(duì)較少。此外，由于核酸在細(xì)胞內(nèi)的含量較穩(wěn)定，也成為測(cè)定生物量的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，魏培蓮等[16]發(fā)現(xiàn)以細(xì)胞中的核酸成分較麥角固醇、氨基葡萄糖量更適合作為土曲霉固態(tài)發(fā)酵物中生物量測(cè)定指標(biāo)。余昌霞等[17]亦證明了以核酸（DNA）含量測(cè)定金針菇菌絲體生物量的方法可行。

本文在水解乳蛋白為適宜氮源、葡萄糖為適宜碳源的基礎(chǔ)上，添加大米、小麥作為碳源，玉米粉、黃豆粉作為氮源，并以菌絲體核酸含量作為間接指標(biāo)測(cè)定菌絲體生物量，確定固體發(fā)酵的最佳配方并測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物的腺苷含量，優(yōu)化中國(guó)被毛孢固體發(fā)酵工藝，以期為中國(guó)被毛胞固體發(fā)酵的產(chǎn)業(yè)化提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

中國(guó)被毛孢菌株（編號(hào)：3.14243），由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所鑒定并提供。

1.1.2 主要儀器與試劑

HPG-280HX人工氣候培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；HZQ-QG旋轉(zhuǎn)式空氣恒溫振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；GUJS 10 L小型發(fā)酵罐，鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司；UV1750紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；Agilent 1200高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技公司等。

腺苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%），中國(guó)食品藥品檢定研究所；中國(guó)被毛孢純菌絲體粉購(gòu)于浙江萬(wàn)豐企業(yè)集團(tuán)制藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 斜面培養(yǎng)

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、胰蛋白胨2 g、水解乳蛋白2 g，KH2PO41 g、MgSO41 g、瓊脂20 g，水1 000 mL，pH 6.5，121℃滅菌30 min。

制備方法：取中國(guó)被毛孢保藏菌種，18℃活化培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接至試管斜面上，長(zhǎng)成菌落直徑約2 cm的斜面種后置4℃冰箱保存，備用。

1.2.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)

（1）液體發(fā)酵培養(yǎng)基

根據(jù)中國(guó)被毛孢液體發(fā)酵經(jīng)驗(yàn)配方，設(shè)置4個(gè)液體發(fā)酵培養(yǎng)基，Y1培養(yǎng)基：葡萄糖30 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、MgSO4·7H2O 1 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、維生素B10.1 g·L-1，pH6.5；Y2培養(yǎng)基：葡萄糖30 g·L-1、水解乳蛋白10 g·L-1、MgSO4·7H2O 1 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、維生素B10.1 g·L-1，pH6.5；Y3培養(yǎng)基：蔗糖30 g·L-1、酵母粉10 g·L-1、MgSO4·7H2O 1 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、維生素B10.1 g·L-1，pH6.5；Y4培養(yǎng)基：淀粉30 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、MgSO4·7H2O 1 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、維生素B10.1 g·L-1，pH 6.5。

（2）制備方法

在500 mL三角瓶中裝入150 mL液體培養(yǎng)基，121℃滅菌30 min后，從斜面種上挑取5塊等大的菌塊接入液體種培養(yǎng)基中，于18℃、150 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)30 d。Y1、Y2、Y3、Y4各配方重復(fù)3次。收集每種配方的純菌絲體，烘干備用。

1.2.3 中國(guó)被毛孢純菌絲體培養(yǎng)基

（1）中國(guó)被毛孢純菌絲體培養(yǎng)基

葡萄糖30 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、MgSO4·7H2O 1 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、維生素B10.1 g·L-1，pH 6.5。

（2）制備方法

在10 L發(fā)酵罐裝入7 L液體培養(yǎng)基，滅菌冷卻后以接種量8%接入培養(yǎng)好的種子液，設(shè)置發(fā)酵溫度為18℃，攪拌速度100 r·min-1，發(fā)酵罐通氣量為4 L·min-1。在此條件下發(fā)酵9 d后，將發(fā)酵液離心（10 025 g，10 min），棄去發(fā)酵液，收集菌絲體，純水洗滌2遍后，低溫烘干至恒重，作為標(biāo)準(zhǔn)菌絲體，繪制菌絲體生物量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.4 固體發(fā)酵培養(yǎng)

（1）固體發(fā)酵種子液培養(yǎng)

種子液培養(yǎng)基按1.2.3（1）；用接種鏟刮取試管斜面菌塊接種到盛有液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中（裝液量為150 mL/500 mL三角瓶），于18℃、150 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)30 d。

（2）固體發(fā)酵培養(yǎng)基

根據(jù)其它蟲(chóng)草無(wú)性型菌株的經(jīng)驗(yàn)配方，以大米、小麥為碳源，以玉米粉、黃豆粉為氮源，對(duì)固體發(fā)酵的碳源、氮源進(jìn)行篩選試驗(yàn)。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g·L-1、水解乳蛋白5 g·L-1、MgSO4·7H2O 1 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、維生素B10.1 g·L-1。除基礎(chǔ)培養(yǎng)基外，添加其它碳源與氮源的總量為20 g，設(shè)置8個(gè)固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)基配方，每個(gè)配方重復(fù)4次，并添加各配方組的空白對(duì)照（不接入種子液），如表1所示。

表1 固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方Tab.1 Composition of solid fermentation medium

稱(chēng)取20 g培養(yǎng)料于250 mL罐頭瓶中，加入30 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，攪拌均勻，采用通氣封瓶膜封口，常溫浸泡12 h。次日于121℃滅菌30 min，然后冷卻降至室溫。挑選菌球密度大、大小均一、不易沉降的種子液，搖勻后精確吸取4 mL，均勻接種于固體培養(yǎng)基表面，在溫度18℃，相對(duì)濕度80%～85%的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)50 d?？瞻讓?duì)照組不接入種子液，其余操作相同。

1.2.5 菌絲體核酸的測(cè)定

（1）純菌絲體中核酸的提取測(cè)定

參照參考文獻(xiàn)[16]方法，分別準(zhǔn)確稱(chēng)取10 L發(fā)酵罐培養(yǎng)所得的中國(guó)被毛孢菌絲體干粉0.05 g、0.1 g、0.15 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g，置于10 mL具塞試管內(nèi)，加入8 mL的5%三氯乙酸溶液，搖勻后80℃水浴提取40 min。取出后冰浴冷卻，離心（8 000 r·min-1，4℃，15 min），取上清液，用5%三氯乙酸溶液定容至10 mL。取定容液，稀釋40倍，以5%三氯乙酸作為空白對(duì)照，于260 nm處測(cè)定OD值，建立菌絲體質(zhì)量（g）與吸光值之間的線(xiàn)性方程。

（2）發(fā)酵物中核酸的提取測(cè)定

各配方固體發(fā)酵物經(jīng)60℃干燥，粉碎。準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g粉末按1.2.5（1）方法提取核酸，未經(jīng)發(fā)酵的固體發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)采用同樣的方法處理作為空白對(duì)照，在260 nm處測(cè)定提取液的OD值，由所測(cè)OD值對(duì)照純菌體與核酸紫外吸收曲線(xiàn)關(guān)系（見(jiàn)圖2），換算成菌絲體量。

1.2.6 固體發(fā)酵物中腺苷含量的測(cè)定

（1）色譜條件

Waters Atlantis T3色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30℃，紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)260 nm，流動(dòng)相20%甲醇-水溶液，流速1 mL·min-1，進(jìn)樣量為20 μL。

（2）腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

精確稱(chēng)取10 mg腺苷標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水溶解于25 mL容量瓶，分別配置1.00 μg·mL-1、2.00 μg·mL-1、5.00 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、20.0 μg·mL-1和40.0 μg·mL-1的腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，在給定的儀器條件下進(jìn)行液相色譜分析，以出峰時(shí)間定性分析，以試樣峰面積對(duì)標(biāo)準(zhǔn)液濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算線(xiàn)性回歸方程為y=43.82x-3.62，R2=0.9999。

（3）樣品腺苷含量的測(cè)定

精確稱(chēng)取2 g固體發(fā)酵物粉末，置于25 mL容量瓶中，加超純水定容，超聲處理1 h，放冷后補(bǔ)水至滿(mǎn)刻度，充分搖勻，8 000 r·min-1，離心5 min，取適量上清液經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾后供液相色譜檢測(cè)用。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲體質(zhì)量與核酸含量的線(xiàn)性關(guān)系

研究表明，核酸在細(xì)胞中含量穩(wěn)定，不受營(yíng)養(yǎng)條件、菌齡等因素的影響，理論上講應(yīng)與生物量具有較好的線(xiàn)性關(guān)系。菌絲體質(zhì)量與核酸OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

圖1 菌絲體質(zhì)量與核酸OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Standard curve between amount of mycelia and nucleic acid content

由圖1可知，中國(guó)被毛孢純菌絲體質(zhì)量與吸光度之間具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。線(xiàn)性方程y=2.536x+0.021，相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.9994。

2.2 不同來(lái)源的中國(guó)被毛孢菌絲體中核酸含量

不同來(lái)源的中國(guó)被毛孢菌絲體中核酸含量情況見(jiàn)表2。

表2 不同來(lái)源的中國(guó)被毛孢菌絲體中核酸含量Tab.2 Nucleic acid content of Hirsutella sinensis mycelium from different sources

由表2可知，液體發(fā)酵所得菌絲體、純菌絲體與市售中國(guó)被毛孢菌絲體中核酸含量相差不大。說(shuō)明培養(yǎng)基中碳源、氮源、營(yíng)養(yǎng)素，以及培養(yǎng)條件對(duì)菌絲體中核酸的影響較小，進(jìn)一步驗(yàn)證了核酸作為中國(guó)被毛孢菌絲體生物量的表征指標(biāo)之一。

2.3 固體發(fā)酵菌絲體生長(zhǎng)情況

不同配方條件下，中國(guó)被毛孢生長(zhǎng)情況見(jiàn)表3。

表3 中國(guó)被毛孢菌絲生長(zhǎng)情況Tab.3 Growth of Hirsutella sinensis mycelium

由表3可知，在3 d～5 d各配方均有菌絲體萌發(fā)生長(zhǎng)，其中G7配方菌絲體長(zhǎng)勢(shì)良好。發(fā)酵培養(yǎng)50 d后，不同配方的中國(guó)被毛孢菌落形態(tài)特征差異較為明顯，配方G1、G2、G4僅在培養(yǎng)基表面出現(xiàn)呈灰白色的菌絲體，配方G1、G2表面無(wú)明顯菌落，培養(yǎng)基內(nèi)也無(wú)菌絲體，而配方G4表面則呈現(xiàn)少量不規(guī)則菌落，培養(yǎng)基內(nèi)則看到少量菌絲體。配方G3、G5、G6、G8的培養(yǎng)基表面出現(xiàn)呈灰白色的菌絲體，形成部分不規(guī)則的菌落，而培養(yǎng)基內(nèi)部亦發(fā)現(xiàn)稀松至較密集的菌絲體。配方G7整個(gè)培養(yǎng)基表面出現(xiàn)呈灰白至亮白色的成片規(guī)則菌落，培養(yǎng)基內(nèi)菌絲體密集，長(zhǎng)勢(shì)良好。結(jié)果表明，在水解乳蛋白為動(dòng)物型氮源基礎(chǔ)上，僅以大米、小麥作為單一碳源時(shí)，中國(guó)被毛孢的長(zhǎng)勢(shì)較差，在培養(yǎng)基表面僅形成了部分的菌絲組織，隨著時(shí)間增加，菌落幾乎無(wú)變化。

而在單一碳源基礎(chǔ)上再添加玉米粉、黃豆粉植物型氮源，中國(guó)被毛孢菌絲體長(zhǎng)勢(shì)表現(xiàn)為玉米粉好于黃豆粉，說(shuō)明在本文配方中，玉米粉作為氮源更適于中國(guó)被毛孢菌絲體生長(zhǎng)。進(jìn)一步研究表明，以大米、小麥作為復(fù)合碳源，添加玉米粉和黃豆粉，中國(guó)被毛孢菌絲體長(zhǎng)勢(shì)表現(xiàn)為玉米粉好于黃豆粉。研究也表明，動(dòng)物型氮源更適于中國(guó)被毛孢生長(zhǎng)，本文則發(fā)現(xiàn)動(dòng)物型氮源與植物型氮源合理組合，更利于中國(guó)被毛孢菌絲體生長(zhǎng)，并隨著碳源種類(lèi)的增加，可獲得長(zhǎng)勢(shì)良好和菌落密集的中國(guó)被毛孢菌絲體。因此，在配方中將不同種類(lèi)碳源與動(dòng)物型氮源、植物型氮源合理搭配，可有效提高中國(guó)被毛孢固體發(fā)酵的產(chǎn)率。

2.4 固體發(fā)酵物中菌絲體含量

不同配方對(duì)中國(guó)被毛孢菌絲體生物量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同固體發(fā)酵配方中發(fā)酵物菌絲體含量Fig.2 Mycelium content in different solid fermentation formulas

由圖2可知，固體發(fā)酵配方G3、G5、G7、G8中菌絲體含量較高，超過(guò)37 mg·g-1，其中配方G7中菌絲體含量高達(dá)80.70 mg·g-1；而配方G1、G2、G4、G6中菌絲體含量較低。以菌落生物量為指標(biāo)，最佳碳源、氮源配方依次為：G7＞G3＞G5＞G8＞G6＞G2＞G1＞G4，并結(jié)合菌絲體的生長(zhǎng)情況，在配方中添加大米、小麥為復(fù)合碳源，玉米粉、水解乳蛋白為復(fù)合氮源，能有效增加中國(guó)被毛孢菌絲體的生物量。

2.5 優(yōu)化配方固體發(fā)酵物中腺苷含量

腺苷標(biāo)準(zhǔn)品和固體發(fā)酵物的HPLC色譜圖見(jiàn)圖3。不同固體發(fā)酵配方（4個(gè)較優(yōu)配方）發(fā)酵物中腺苷含量情況見(jiàn)圖4。

圖3 腺苷標(biāo)準(zhǔn)品（a）和固體發(fā)酵物的HPLC色譜圖（b）Fig.3 HPLC chromatograms of adenosine standard(a)and solid fermentation samples(b)

圖4 不同固體發(fā)酵配方發(fā)酵物中腺苷含量Fig.4 Content of adenosine in solid fermentation formulas

圖3結(jié)果顯示，由固體發(fā)酵獲得中國(guó)被毛孢菌絲體中的腺苷具有良好的峰形和分離度。根據(jù)不同配方固體發(fā)酵菌絲體生長(zhǎng)情況及生物量結(jié)果，得到4個(gè)中國(guó)被毛孢固體發(fā)酵較優(yōu)配方（配方G3、G5、G7、G8）。配方G7中腺苷含量高達(dá)63.76 μg·g-1，配方G3次之，配方G5、G8中腺苷含量較少，并且腺苷含量與菌絲體含量的變化呈正相關(guān)，而配方G8中以黃豆粉為復(fù)合氮源，其生物量和腺苷含量均小于以玉米粉為復(fù)合氮源的配方，進(jìn)一步證明了在固體發(fā)酵配方中添加玉米作為復(fù)合氮源，能有效改善中國(guó)被毛孢菌絲體的長(zhǎng)勢(shì)以及提高菌絲體有效成分的含量。

3 結(jié)論

中國(guó)被毛孢作為1種真菌，其菌絲體生長(zhǎng)繁殖離不開(kāi)碳氮源等營(yíng)養(yǎng)成分。由于核酸在細(xì)胞內(nèi)的含量較穩(wěn)定，不受培養(yǎng)條件影響，因此，本研究首先驗(yàn)證核酸能作為生物量的間接指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)菌絲體質(zhì)量與核酸含量呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。同時(shí)在配方中將不同種類(lèi)碳源與動(dòng)物型氮源、植物型氮源合理搭配，并從8種固體發(fā)酵配方中篩選出以大米和小麥作為復(fù)合碳源，玉米粉為復(fù)合植物型氮源的配方，獲得的菌絲長(zhǎng)勢(shì)最佳，其生物量和功效成分腺苷含量最高。

目前關(guān)于中國(guó)被毛孢固體發(fā)酵的研究較少，并且固體發(fā)酵研究主要以菌絲體生物量為指標(biāo)，以功能成分為指標(biāo)的研究不多。本文以核酸含量作為間接指標(biāo)評(píng)價(jià)菌絲體含量，篩選出中國(guó)被毛孢較佳的固體發(fā)酵配方工藝，進(jìn)一步地以功能成分腺苷含量作為指標(biāo)，獲得以大米和小麥作為復(fù)合碳源，玉米粉為復(fù)合植物型氮源的最佳配方。前期研究主要確定碳源、氮源種類(lèi)并在添加量基礎(chǔ)上選用了2種植物型氮源，由于植物型和動(dòng)物型氮源的來(lái)源較多，下一步將繼續(xù)針對(duì)不同種類(lèi)碳源、氮源及其添加量進(jìn)行更深入研究，以期為中國(guó)被毛孢固體發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)提供更多研究數(shù)據(jù)。

[1]Varshney VK,Pandey A,Kumar A,et al.Chemical screening and identification of high cordycepin containing cultured isolate(s)of medicinal Chinese caterpillar mushroom,Ophiocordyceps sinensis(Berk.)G.H.Sung et al[J].International Journal of Medicinal Mushrooms,2011,13(4):327.

[2]Chen J,Zhang W,Lu T,et al.Morphological and genetic characterization of a cultivated Cordyceps sinensis fungus and its polysaccharide component possessing antioxidant property in H22 tumor-bearing mice[J].Life Sciences,2006,78(23):2742.

[3]Zhang W,Yang J,Chen J,et al.Immunomodulatory and antitumour effects of an exopolysaccharide fraction from cultivated Cordyceps sinensis(Chinese caterpillar fungus)on tumourbearing mice[J].Biotechnology&Applied Biochemistry,2005,42(1):9-15.

[4]Lee JS,Hong EK.Immunostimulating activity of the polysaccharides isolated from Cordyceps militaris[J].International Immunopharmacology,2011,11(9):1226.

[5]王林萍，余意，馮成強(qiáng).冬蟲(chóng)夏草活性成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2014，21（7）：132-136.

[6]勞景輝，閆文娟，方佳茂，等.冬蟲(chóng)夏草發(fā)酵技術(shù)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)食用菌，2012，31（6）：5-7.

[7]劉錫琎，郭英蘭，俞尤信，等.冬蟲(chóng)夏草菌無(wú)性階段的分離和鑒定[J].菌物學(xué)報(bào)，1989（1）：35-39.

[8]Kirk P,Cannon P,Minter D,et al.Dictionary of the Fungi(10th Edition)[M].Wallingford:CAB International,2008:507-508.

[9]傅惠英，張利棕，壽旗揚(yáng)，等.中國(guó)被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉小鼠免疫功能調(diào)節(jié)作用的比較[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2012，22（9）：16-20.

[10]張安寧，袁書(shū)林，孫林超，等.4種蟲(chóng)草真菌生長(zhǎng)適宜碳、氮源的研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（6）：404-406.

[11]周宇爝，江明艷，姜福星，等.不同氮源對(duì)中國(guó)被毛孢生長(zhǎng)的影響[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，40（18）：22-24.

[12]李春如，彭凡，樊美珍，等.中國(guó)被毛孢RCEF0273培養(yǎng)工藝的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，31（4）：460-465.

[13]秦鵬，趙玉卉，王龍，等.冬蟲(chóng)夏草無(wú)性型發(fā)酵技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造，2014，33（6）：10-12.

[14]葛飛，桂琳，李春如，等.冬蟲(chóng)夏草無(wú)性型-中國(guó)被毛孢固態(tài)發(fā)酵條件的初步研究[J].生物學(xué)雜志，2009，26（3）：22-25.

[15]葛飛，李春如，胡豐林，等.不同培養(yǎng)條件對(duì)中國(guó)被毛孢胞內(nèi)核苷類(lèi)組分的影響[J].菌物學(xué)報(bào)，2007，26（2）：234-242.

[16]魏培蓮，岑沛霖，盛春琦.3種固態(tài)發(fā)酵生物量測(cè)定方法的比較[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2006，25（1）：60-64.

[17]余昌霞，陳建華，曹暉，等.金針菇不同生長(zhǎng)時(shí)期培養(yǎng)基質(zhì)中菌絲相對(duì)生物量的確定[J].食用菌學(xué)報(bào)，2014（2）：19-24.