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        不同碳源、氮源對(duì)中國(guó)被毛孢固體發(fā)酵工藝的影響*

        2018-01-27 05:27:27陳家明馬詩(shī)經(jīng)焦春偉張命龍陳天洪謝意珍李崇李良秋楊偉君
        中國(guó)食用菌 2018年1期
        關(guān)鍵詞:菌絲體腺苷氮源

        陳家明,馬詩(shī)經(jīng),焦春偉,張命龍,陳天洪,謝意珍,2**,李崇,2,李良秋,2,楊偉君

        (1.廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司,廣東廣州510663;2.廣東省微生物研究所,廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州510070)

        冬蟲(chóng)夏草[Ophiocordyceps sinensis(Berk.)G.H.Sung et al.]是珍貴的蟲(chóng)生真菌[1],具有良好的補(bǔ)肺益腎、抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、調(diào)節(jié)免疫[4]、抗衰老、降血糖等功效[5]。但存在野生資源匱乏,人工培育尚存技術(shù)困難等問(wèn)題。加之過(guò)度采挖,目前野生的冬蟲(chóng)夏草已處于瀕危狀態(tài)[6]。中國(guó)被毛孢(Hirsutella sinensis)已被證實(shí)為冬蟲(chóng)夏草的無(wú)性型[7-8],含有核苷、多糖和甾醇等與冬蟲(chóng)夏草類(lèi)似的有效成分,具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等作用[9],成為冬蟲(chóng)夏草最佳的替代品。目前,國(guó)內(nèi)中國(guó)被毛孢以液體發(fā)酵為主,但液體發(fā)酵對(duì)設(shè)備要求高、工藝較復(fù)雜、成本高以及發(fā)酵過(guò)程易污染。而固體發(fā)酵具有原料低廉,設(shè)備和工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),部分研究者對(duì)中國(guó)被毛孢進(jìn)行固體發(fā)酵研究,并取得一定的成果。

        研究表明,添加不同類(lèi)型的碳源、氮源對(duì)中國(guó)被毛孢發(fā)酵過(guò)程的生物量和生長(zhǎng)情況影響較大[10-11],其中以葡萄糖、蔗糖為碳源,蠶蛹粉、酵母粉、蛋白胨等較有利于中國(guó)被毛孢的生長(zhǎng)[12]。目前,文獻(xiàn)報(bào)道以菌絲體生物量為指標(biāo),對(duì)中國(guó)被毛孢固體、液體發(fā)酵工藝、參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化研究為主[13],以功能成分如麥角甾醇[14]、核苷類(lèi)物質(zhì)[15]等作為指標(biāo)的研究相對(duì)較少。此外,由于核酸在細(xì)胞內(nèi)的含量較穩(wěn)定,也成為測(cè)定生物量的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一,魏培蓮等[16]發(fā)現(xiàn)以細(xì)胞中的核酸成分較麥角固醇、氨基葡萄糖量更適合作為土曲霉固態(tài)發(fā)酵物中生物量測(cè)定指標(biāo)。余昌霞等[17]亦證明了以核酸(DNA)含量測(cè)定金針菇菌絲體生物量的方法可行。

        本文在水解乳蛋白為適宜氮源、葡萄糖為適宜碳源的基礎(chǔ)上,添加大米、小麥作為碳源,玉米粉、黃豆粉作為氮源,并以菌絲體核酸含量作為間接指標(biāo)測(cè)定菌絲體生物量,確定固體發(fā)酵的最佳配方并測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物的腺苷含量,優(yōu)化中國(guó)被毛孢固體發(fā)酵工藝,以期為中國(guó)被毛胞固體發(fā)酵的產(chǎn)業(yè)化提供研究基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 供試菌株

        中國(guó)被毛孢菌株(編號(hào):3.14243),由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所鑒定并提供。

        1.1.2 主要儀器與試劑

        HPG-280HX人工氣候培養(yǎng)箱,哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;HZQ-QG旋轉(zhuǎn)式空氣恒溫振蕩器,哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;GUJS 10 L小型發(fā)酵罐,鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司;UV1750紫外分光光度計(jì),日本島津公司;Agilent 1200高效液相色譜儀,美國(guó)安捷倫科技公司等。

        腺苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%),中國(guó)食品藥品檢定研究所;中國(guó)被毛孢純菌絲體粉購(gòu)于浙江萬(wàn)豐企業(yè)集團(tuán)制藥有限公司。

        1.2 方法

        1.2.1 斜面培養(yǎng)

        斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯(去皮)200 g、葡萄糖20 g、胰蛋白胨2 g、水解乳蛋白2 g,KH2PO41 g、MgSO41 g、瓊脂20 g,水1 000 mL,pH 6.5,121℃滅菌30 min。

        制備方法:取中國(guó)被毛孢保藏菌種,18℃活化培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接至試管斜面上,長(zhǎng)成菌落直徑約2 cm的斜面種后置4℃冰箱保存,備用。

        1.2.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)

        (1)液體發(fā)酵培養(yǎng)基

        根據(jù)中國(guó)被毛孢液體發(fā)酵經(jīng)驗(yàn)配方,設(shè)置4個(gè)液體發(fā)酵培養(yǎng)基,Y1培養(yǎng)基:葡萄糖30 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、MgSO4·7H2O 1 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、維生素B10.1 g·L-1,pH6.5;Y2培養(yǎng)基:葡萄糖30 g·L-1、水解乳蛋白10 g·L-1、MgSO4·7H2O 1 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、維生素B10.1 g·L-1,pH6.5;Y3培養(yǎng)基:蔗糖30 g·L-1、酵母粉10 g·L-1、MgSO4·7H2O 1 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、維生素B10.1 g·L-1,pH6.5;Y4培養(yǎng)基:淀粉30 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、MgSO4·7H2O 1 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、維生素B10.1 g·L-1,pH 6.5。

        (2)制備方法

        在500 mL三角瓶中裝入150 mL液體培養(yǎng)基,121℃滅菌30 min后,從斜面種上挑取5塊等大的菌塊接入液體種培養(yǎng)基中,于18℃、150 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)30 d。Y1、Y2、Y3、Y4各配方重復(fù)3次。收集每種配方的純菌絲體,烘干備用。

        1.2.3 中國(guó)被毛孢純菌絲體培養(yǎng)基

        (1)中國(guó)被毛孢純菌絲體培養(yǎng)基

        葡萄糖30 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、MgSO4·7H2O 1 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、維生素B10.1 g·L-1,pH 6.5。

        (2)制備方法

        在10 L發(fā)酵罐裝入7 L液體培養(yǎng)基,滅菌冷卻后以接種量8%接入培養(yǎng)好的種子液,設(shè)置發(fā)酵溫度為18℃,攪拌速度100 r·min-1,發(fā)酵罐通氣量為4 L·min-1。在此條件下發(fā)酵9 d后,將發(fā)酵液離心(10 025 g,10 min),棄去發(fā)酵液,收集菌絲體,純水洗滌2遍后,低溫烘干至恒重,作為標(biāo)準(zhǔn)菌絲體,繪制菌絲體生物量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

        1.2.4 固體發(fā)酵培養(yǎng)

        (1)固體發(fā)酵種子液培養(yǎng)

        種子液培養(yǎng)基按1.2.3(1);用接種鏟刮取試管斜面菌塊接種到盛有液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中(裝液量為150 mL/500 mL三角瓶),于18℃、150 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)30 d。

        (2)固體發(fā)酵培養(yǎng)基

        根據(jù)其它蟲(chóng)草無(wú)性型菌株的經(jīng)驗(yàn)配方,以大米、小麥為碳源,以玉米粉、黃豆粉為氮源,對(duì)固體發(fā)酵的碳源、氮源進(jìn)行篩選試驗(yàn)。

        基礎(chǔ)培養(yǎng)基:葡萄糖20 g·L-1、水解乳蛋白5 g·L-1、MgSO4·7H2O 1 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、維生素B10.1 g·L-1。除基礎(chǔ)培養(yǎng)基外,添加其它碳源與氮源的總量為20 g,設(shè)置8個(gè)固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)基配方,每個(gè)配方重復(fù)4次,并添加各配方組的空白對(duì)照(不接入種子液),如表1所示。

        表1 固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方Tab.1 Composition of solid fermentation medium

        稱(chēng)取20 g培養(yǎng)料于250 mL罐頭瓶中,加入30 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基,攪拌均勻,采用通氣封瓶膜封口,常溫浸泡12 h。次日于121℃滅菌30 min,然后冷卻降至室溫。挑選菌球密度大、大小均一、不易沉降的種子液,搖勻后精確吸取4 mL,均勻接種于固體培養(yǎng)基表面,在溫度18℃,相對(duì)濕度80%~85%的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)50 d??瞻讓?duì)照組不接入種子液,其余操作相同。

        1.2.5 菌絲體核酸的測(cè)定

        (1)純菌絲體中核酸的提取測(cè)定

        參照參考文獻(xiàn)[16]方法,分別準(zhǔn)確稱(chēng)取10 L發(fā)酵罐培養(yǎng)所得的中國(guó)被毛孢菌絲體干粉0.05 g、0.1 g、0.15 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g,置于10 mL具塞試管內(nèi),加入8 mL的5%三氯乙酸溶液,搖勻后80℃水浴提取40 min。取出后冰浴冷卻,離心(8 000 r·min-1,4℃,15 min),取上清液,用5%三氯乙酸溶液定容至10 mL。取定容液,稀釋40倍,以5%三氯乙酸作為空白對(duì)照,于260 nm處測(cè)定OD值,建立菌絲體質(zhì)量(g)與吸光值之間的線(xiàn)性方程。

        (2)發(fā)酵物中核酸的提取測(cè)定

        各配方固體發(fā)酵物經(jīng)60℃干燥,粉碎。準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g粉末按1.2.5(1)方法提取核酸,未經(jīng)發(fā)酵的固體發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)采用同樣的方法處理作為空白對(duì)照,在260 nm處測(cè)定提取液的OD值,由所測(cè)OD值對(duì)照純菌體與核酸紫外吸收曲線(xiàn)關(guān)系(見(jiàn)圖2),換算成菌絲體量。

        1.2.6 固體發(fā)酵物中腺苷含量的測(cè)定

        (1)色譜條件

        Waters Atlantis T3色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱溫30℃,紫外檢測(cè)器,波長(zhǎng)260 nm,流動(dòng)相20%甲醇-水溶液,流速1 mL·min-1,進(jìn)樣量為20 μL。

        (2)腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

        精確稱(chēng)取10 mg腺苷標(biāo)準(zhǔn)品,用超純水溶解于25 mL容量瓶,分別配置1.00 μg·mL-1、2.00 μg·mL-1、5.00 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、20.0 μg·mL-1和40.0 μg·mL-1的腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液,在給定的儀器條件下進(jìn)行液相色譜分析,以出峰時(shí)間定性分析,以試樣峰面積對(duì)標(biāo)準(zhǔn)液濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),計(jì)算線(xiàn)性回歸方程為y=43.82x-3.62,R2=0.9999。

        (3)樣品腺苷含量的測(cè)定

        精確稱(chēng)取2 g固體發(fā)酵物粉末,置于25 mL容量瓶中,加超純水定容,超聲處理1 h,放冷后補(bǔ)水至滿(mǎn)刻度,充分搖勻,8 000 r·min-1,離心5 min,取適量上清液經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾后供液相色譜檢測(cè)用。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),計(jì)算含量。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 菌絲體質(zhì)量與核酸含量的線(xiàn)性關(guān)系

        研究表明,核酸在細(xì)胞中含量穩(wěn)定,不受營(yíng)養(yǎng)條件、菌齡等因素的影響,理論上講應(yīng)與生物量具有較好的線(xiàn)性關(guān)系。菌絲體質(zhì)量與核酸OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

        圖1 菌絲體質(zhì)量與核酸OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Standard curve between amount of mycelia and nucleic acid content

        由圖1可知,中國(guó)被毛孢純菌絲體質(zhì)量與吸光度之間具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。線(xiàn)性方程y=2.536x+0.021,相關(guān)性良好,相關(guān)系數(shù)R2=0.9994。

        2.2 不同來(lái)源的中國(guó)被毛孢菌絲體中核酸含量

        不同來(lái)源的中國(guó)被毛孢菌絲體中核酸含量情況見(jiàn)表2。

        表2 不同來(lái)源的中國(guó)被毛孢菌絲體中核酸含量Tab.2 Nucleic acid content of Hirsutella sinensis mycelium from different sources

        由表2可知,液體發(fā)酵所得菌絲體、純菌絲體與市售中國(guó)被毛孢菌絲體中核酸含量相差不大。說(shuō)明培養(yǎng)基中碳源、氮源、營(yíng)養(yǎng)素,以及培養(yǎng)條件對(duì)菌絲體中核酸的影響較小,進(jìn)一步驗(yàn)證了核酸作為中國(guó)被毛孢菌絲體生物量的表征指標(biāo)之一。

        2.3 固體發(fā)酵菌絲體生長(zhǎng)情況

        不同配方條件下,中國(guó)被毛孢生長(zhǎng)情況見(jiàn)表3。

        表3 中國(guó)被毛孢菌絲生長(zhǎng)情況Tab.3 Growth of Hirsutella sinensis mycelium

        由表3可知,在3 d~5 d各配方均有菌絲體萌發(fā)生長(zhǎng),其中G7配方菌絲體長(zhǎng)勢(shì)良好。發(fā)酵培養(yǎng)50 d后,不同配方的中國(guó)被毛孢菌落形態(tài)特征差異較為明顯,配方G1、G2、G4僅在培養(yǎng)基表面出現(xiàn)呈灰白色的菌絲體,配方G1、G2表面無(wú)明顯菌落,培養(yǎng)基內(nèi)也無(wú)菌絲體,而配方G4表面則呈現(xiàn)少量不規(guī)則菌落,培養(yǎng)基內(nèi)則看到少量菌絲體。配方G3、G5、G6、G8的培養(yǎng)基表面出現(xiàn)呈灰白色的菌絲體,形成部分不規(guī)則的菌落,而培養(yǎng)基內(nèi)部亦發(fā)現(xiàn)稀松至較密集的菌絲體。配方G7整個(gè)培養(yǎng)基表面出現(xiàn)呈灰白至亮白色的成片規(guī)則菌落,培養(yǎng)基內(nèi)菌絲體密集,長(zhǎng)勢(shì)良好。結(jié)果表明,在水解乳蛋白為動(dòng)物型氮源基礎(chǔ)上,僅以大米、小麥作為單一碳源時(shí),中國(guó)被毛孢的長(zhǎng)勢(shì)較差,在培養(yǎng)基表面僅形成了部分的菌絲組織,隨著時(shí)間增加,菌落幾乎無(wú)變化。

        而在單一碳源基礎(chǔ)上再添加玉米粉、黃豆粉植物型氮源,中國(guó)被毛孢菌絲體長(zhǎng)勢(shì)表現(xiàn)為玉米粉好于黃豆粉,說(shuō)明在本文配方中,玉米粉作為氮源更適于中國(guó)被毛孢菌絲體生長(zhǎng)。進(jìn)一步研究表明,以大米、小麥作為復(fù)合碳源,添加玉米粉和黃豆粉,中國(guó)被毛孢菌絲體長(zhǎng)勢(shì)表現(xiàn)為玉米粉好于黃豆粉。研究也表明,動(dòng)物型氮源更適于中國(guó)被毛孢生長(zhǎng),本文則發(fā)現(xiàn)動(dòng)物型氮源與植物型氮源合理組合,更利于中國(guó)被毛孢菌絲體生長(zhǎng),并隨著碳源種類(lèi)的增加,可獲得長(zhǎng)勢(shì)良好和菌落密集的中國(guó)被毛孢菌絲體。因此,在配方中將不同種類(lèi)碳源與動(dòng)物型氮源、植物型氮源合理搭配,可有效提高中國(guó)被毛孢固體發(fā)酵的產(chǎn)率。

        2.4 固體發(fā)酵物中菌絲體含量

        不同配方對(duì)中國(guó)被毛孢菌絲體生物量的影響見(jiàn)圖2。

        圖2 不同固體發(fā)酵配方中發(fā)酵物菌絲體含量Fig.2 Mycelium content in different solid fermentation formulas

        由圖2可知,固體發(fā)酵配方G3、G5、G7、G8中菌絲體含量較高,超過(guò)37 mg·g-1,其中配方G7中菌絲體含量高達(dá)80.70 mg·g-1;而配方G1、G2、G4、G6中菌絲體含量較低。以菌落生物量為指標(biāo),最佳碳源、氮源配方依次為:G7>G3>G5>G8>G6>G2>G1>G4,并結(jié)合菌絲體的生長(zhǎng)情況,在配方中添加大米、小麥為復(fù)合碳源,玉米粉、水解乳蛋白為復(fù)合氮源,能有效增加中國(guó)被毛孢菌絲體的生物量。

        2.5 優(yōu)化配方固體發(fā)酵物中腺苷含量

        腺苷標(biāo)準(zhǔn)品和固體發(fā)酵物的HPLC色譜圖見(jiàn)圖3。不同固體發(fā)酵配方(4個(gè)較優(yōu)配方)發(fā)酵物中腺苷含量情況見(jiàn)圖4。

        圖3 腺苷標(biāo)準(zhǔn)品(a)和固體發(fā)酵物的HPLC色譜圖(b)Fig.3 HPLC chromatograms of adenosine standard(a)and solid fermentation samples(b)

        圖4 不同固體發(fā)酵配方發(fā)酵物中腺苷含量Fig.4 Content of adenosine in solid fermentation formulas

        圖3結(jié)果顯示,由固體發(fā)酵獲得中國(guó)被毛孢菌絲體中的腺苷具有良好的峰形和分離度。根據(jù)不同配方固體發(fā)酵菌絲體生長(zhǎng)情況及生物量結(jié)果,得到4個(gè)中國(guó)被毛孢固體發(fā)酵較優(yōu)配方(配方G3、G5、G7、G8)。配方G7中腺苷含量高達(dá)63.76 μg·g-1,配方G3次之,配方G5、G8中腺苷含量較少,并且腺苷含量與菌絲體含量的變化呈正相關(guān),而配方G8中以黃豆粉為復(fù)合氮源,其生物量和腺苷含量均小于以玉米粉為復(fù)合氮源的配方,進(jìn)一步證明了在固體發(fā)酵配方中添加玉米作為復(fù)合氮源,能有效改善中國(guó)被毛孢菌絲體的長(zhǎng)勢(shì)以及提高菌絲體有效成分的含量。

        3 結(jié)論

        中國(guó)被毛孢作為1種真菌,其菌絲體生長(zhǎng)繁殖離不開(kāi)碳氮源等營(yíng)養(yǎng)成分。由于核酸在細(xì)胞內(nèi)的含量較穩(wěn)定,不受培養(yǎng)條件影響,因此,本研究首先驗(yàn)證核酸能作為生物量的間接指標(biāo),發(fā)現(xiàn)菌絲體質(zhì)量與核酸含量呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。同時(shí)在配方中將不同種類(lèi)碳源與動(dòng)物型氮源、植物型氮源合理搭配,并從8種固體發(fā)酵配方中篩選出以大米和小麥作為復(fù)合碳源,玉米粉為復(fù)合植物型氮源的配方,獲得的菌絲長(zhǎng)勢(shì)最佳,其生物量和功效成分腺苷含量最高。

        目前關(guān)于中國(guó)被毛孢固體發(fā)酵的研究較少,并且固體發(fā)酵研究主要以菌絲體生物量為指標(biāo),以功能成分為指標(biāo)的研究不多。本文以核酸含量作為間接指標(biāo)評(píng)價(jià)菌絲體含量,篩選出中國(guó)被毛孢較佳的固體發(fā)酵配方工藝,進(jìn)一步地以功能成分腺苷含量作為指標(biāo),獲得以大米和小麥作為復(fù)合碳源,玉米粉為復(fù)合植物型氮源的最佳配方。前期研究主要確定碳源、氮源種類(lèi)并在添加量基礎(chǔ)上選用了2種植物型氮源,由于植物型和動(dòng)物型氮源的來(lái)源較多,下一步將繼續(xù)針對(duì)不同種類(lèi)碳源、氮源及其添加量進(jìn)行更深入研究,以期為中國(guó)被毛孢固體發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)提供更多研究數(shù)據(jù)。

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