溫志新，孟楠，李學(xué)軍，都興范，馬淑慧，米銳，孫永欣，李樹(shù)英，李亞潔

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大連生物技術(shù)研究所，遼寧大連116024）

蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris），又名北冬蟲(chóng)夏草，北蟲(chóng)草，是1種蟲(chóng)菌結(jié)合的藥用兼食用真菌，與冬蟲(chóng)夏草（Cordyceps sinensis）同屬異種，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，隨著冬蟲(chóng)夏草數(shù)量日趨減少，蛹蟲(chóng)草越來(lái)越受到人們的認(rèn)可[1-2]，近年來(lái)，蛹蟲(chóng)草人工栽培已經(jīng)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，但由于生產(chǎn)中菌種不穩(wěn)定，長(zhǎng)期冷藏菌種衰老、退化，從而影響蛹蟲(chóng)草規(guī)?；a(chǎn)[3]。目前，針對(duì)蛹蟲(chóng)草菌種退化問(wèn)題，通常采用組織分離法、孢子分離法和蟲(chóng)體回接法對(duì)菌種進(jìn)行復(fù)壯[4-8]，其中蟲(chóng)體回接法被認(rèn)為是1種有效的菌種復(fù)壯方式，許多研究表明，蟲(chóng)體回接可以使蟲(chóng)生真菌對(duì)昆蟲(chóng)的毒力得到回復(fù)，原有的生物學(xué)性狀也得以穩(wěn)定[9]。本文以活體柞蠶蛹培育蛹蟲(chóng)草，選擇不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的樣品進(jìn)行組織分離，研究蟲(chóng)體復(fù)壯對(duì)母種質(zhì)量的影響，為規(guī)模化生產(chǎn)提供性狀穩(wěn)定的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：北蟲(chóng)草冰峪2號(hào)，由本實(shí)驗(yàn)室提供。主要試劑：葡萄糖、蛋白胨、瓊脂粉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、維生素B等（均為分析純）。

培養(yǎng)原料：柞蠶蛹購(gòu)于遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所，小麥（市售）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備

母種培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、蔗糖2%、牛肉膏1%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.05%、瓊脂2%。采用180 mm×18 mm的試管分裝培養(yǎng)基，每支試管10 mL，加蓋棉塞，高壓滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌30 min，完成后取出擺斜面，冷卻，無(wú)菌檢驗(yàn)后待用。培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻到45℃，傾入直徑6.5 cm無(wú)菌平皿中，冷卻，無(wú)菌檢驗(yàn)后待用。

液體培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、蔗糖2%、磷酸二氫鉀0.3%、硫酸鎂0.15%、蛋白胨1%，分裝500 mL三角瓶中（150 mL），加蓋棉塞，高壓滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌30 min，冷卻，無(wú)菌檢驗(yàn)后待用。

小麥培養(yǎng)基：小麥粒25 g，料液比1∶1.5，裝于500 mL罐頭瓶。營(yíng)養(yǎng)液配方：葡萄糖2%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.05%，用自來(lái)水配制。高壓滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌1 h，冷卻待用。

柞蠶蛹準(zhǔn)備：選取健康柞蠶滯育蛹，用75%乙醇迅速擦洗蠶蛹體表。尤其是節(jié)間膜處（或?qū)⑿Q蛹用75%乙醇浸泡2 min），再用無(wú)菌水洗去殘留酒精，放在無(wú)菌托盤中晾干備用。

1.2.2 液體菌種制作

將試管母種接入上述液體培養(yǎng)基中，24℃恒溫靜止培養(yǎng)2 d后，再振蕩培養(yǎng)5 d～7 d，4層紗布過(guò)濾。備用。

1.2.3 柞蠶蛹接種培養(yǎng)

取上述菌液注射于蠶蛹，每只蠶蛹注射量0.2 mL～0.4 mL，然后把接種后的柞蠶蛹放在消過(guò)毒的塑料盒中，送入培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)至子實(shí)體成熟[10]。

1.2.4 組織分離培養(yǎng)

分別選取僵蛹（S1）、子實(shí)體初期（子實(shí)體＜1 cm，S2）、子實(shí)體早期（1 cm＜子實(shí)體＜3 cm，S3）、子實(shí)體中期（子實(shí)體≈5 cm，S4）、子實(shí)體成熟期（子實(shí)體＞7 cm，S5）的生長(zhǎng)發(fā)育良好且未被污染的蟲(chóng)草組織。具體操作：僵蛹（S1）選取接種15 d后僵化的蠶蛹，無(wú)菌條件下切開(kāi)蛹體，接種針挑取內(nèi)部長(zhǎng)滿菌絲的組織塊，接入平板培養(yǎng)基中央，適宜溫度下培養(yǎng)；子實(shí)體生長(zhǎng)時(shí)期按生長(zhǎng)時(shí)間與長(zhǎng)度選取蛹蟲(chóng)草形態(tài)良好并生長(zhǎng)健壯的子實(shí)體，以子實(shí)體中上部為目標(biāo)組織塊，無(wú)菌水清洗3次～5次，無(wú)菌條件下切成長(zhǎng)1 mm的小塊，接入平板培養(yǎng)基中央，適宜溫度下培養(yǎng)。每天觀察記錄組織塊在培養(yǎng)基上的萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)情況。

1.2.5 小麥培養(yǎng)基出草培養(yǎng)

待上述菌塊萌發(fā)后，轉(zhuǎn)入上述試管斜面培養(yǎng)基上，將得到的菌種分別接種于液體培養(yǎng)基中，約5 d～6 d后，將液體菌種接種于小麥培養(yǎng)基中，每個(gè)菌株各接種20個(gè)罐頭瓶。相同條件下培養(yǎng)，待子實(shí)體成熟時(shí)采收，分別記錄子實(shí)體平均長(zhǎng)度、產(chǎn)量并測(cè)定生物轉(zhuǎn)化率。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS17.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因子顯著性檢驗(yàn)，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長(zhǎng)時(shí)期分離母種平板培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)情況

平板培養(yǎng)基上不同生長(zhǎng)時(shí)期分離的蛹蟲(chóng)草母種菌絲生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)色情況見(jiàn)表1。

表1 不同生長(zhǎng)時(shí)期分離的蛹蟲(chóng)草母種菌絲生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)色情況比較Tab.1 Comparison of hypha growth and changing color of Cordyceps militaris in different treatments

從菌絲生長(zhǎng)勢(shì)方面看，S2、S3和S4間沒(méi)有差別，菌絲長(zhǎng)勢(shì)好，健壯，整齊，濃密且轉(zhuǎn)色快，S1和S5菌絲長(zhǎng)勢(shì)較好，濃密但邊緣不整齊，轉(zhuǎn)色稍慢；從菌絲生長(zhǎng)速度方面看，S3生長(zhǎng)最快，日均生長(zhǎng)速度為3.75 mm·d-1，其次是S2和S4，最慢是S5。多重比較表明，S2、S3，與S4分離的母種菌絲日均生長(zhǎng)速度相比差異不顯著，但都與S1、S5兩個(gè)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速度差異顯著，由此可知，經(jīng)蟲(chóng)體回接法獲得的子實(shí)體早期（S3）分離得到母種菌絲體生長(zhǎng)速度最快，長(zhǎng)勢(shì)最好，為母種組織分離的最佳時(shí)期，其次為子實(shí)體初期（S2）。

2.2 不同生長(zhǎng)期分離母種繼代培養(yǎng)對(duì)子實(shí)體產(chǎn)量影響

子實(shí)體采收均統(tǒng)一設(shè)定為接種小麥培養(yǎng)基后培養(yǎng)第40 d采收，經(jīng)繼代培養(yǎng)得到的蟲(chóng)草子實(shí)體指標(biāo)參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 分離母種繼代培養(yǎng)子實(shí)體的生長(zhǎng)性狀調(diào)查Tab.2 Growth status of fruiting body from subculture isolated from mother spawn

由表2可知，從子實(shí)體長(zhǎng)度方面看，S3最長(zhǎng)，但各生長(zhǎng)期分離的菌種繼代間差異不顯著；從每瓶子實(shí)體鮮重與生物轉(zhuǎn)化率方面來(lái)看，S5明顯低于其他各生長(zhǎng)期，差異達(dá)到顯著水平，S3表現(xiàn)最好，其次是S2。說(shuō)明蟲(chóng)體復(fù)壯分離除了子實(shí)體成熟期（S5）以外，其他各生長(zhǎng)期分離母種繼代培養(yǎng)子實(shí)體生長(zhǎng)性狀均表現(xiàn)良好，而S3為最適合的時(shí)期。

3 結(jié)論與討論

本研究利用活體柞蠶蛹復(fù)壯蛹蟲(chóng)草菌種，試驗(yàn)結(jié)果表明，選取不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的蛹蟲(chóng)草組織分離母種，無(wú)論是菌絲生長(zhǎng)勢(shì)還是繼代培養(yǎng)子實(shí)體的生長(zhǎng)性狀，S3均表現(xiàn)最佳，即經(jīng)蟲(chóng)體復(fù)壯獲得的子實(shí)體早期（S3）為最適合的母種組織分離時(shí)期，其后依次是子實(shí)體初期（S2）、子實(shí)體中期（S4）和僵蛹期（S1），最差是子實(shí)體成熟期（S5），可能由于成熟期細(xì)胞老化活力下降而導(dǎo)致分離的母種菌絲長(zhǎng)勢(shì)及繼代培養(yǎng)子實(shí)體生長(zhǎng)效果差[11]，因此，不適合在這個(gè)時(shí)期進(jìn)行組織分離母種。王殿振等[12]采用孢子分離、組織分離、活體蠶蛹、基內(nèi)菌絲分離、蠶蛹回接等5種菌種復(fù)壯法，其中活體蠶蛹復(fù)壯法是當(dāng)子實(shí)體長(zhǎng)到2 cm～3 cm時(shí)做組織分離，而蠶蛹回接采用僵蛹組織塊，試驗(yàn)確定活體蠶蛹復(fù)壯法是5種方法中最好的菌種復(fù)壯法，與本研究結(jié)果基本一致。蛹蟲(chóng)草菌種退化是普遍存在的問(wèn)題，菌種退化的具體機(jī)理目前還不清楚。李美娜等[13]用PCR-RFLP和RAPD方法證實(shí)退化菌株較野生馴化菌株在DNA水平上發(fā)生了頻率較高的突變，這些變異既可能發(fā)生在核基因組，也可能發(fā)生在線粒體基因組。魏靜[14]以蛹蟲(chóng)草同核體菌株中克隆得到2種交配型基因，發(fā)現(xiàn)退化菌株只含有其中的1種類型交配型基因。因此，下一步要從遺傳物質(zhì)DNA著手，尋找更好地解決蛹蟲(chóng)草菌種退化問(wèn)題的辦法，為生產(chǎn)實(shí)踐提供參考。

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