喬振宇＊，王 ?。?，呂曉業(yè)，黃 芳，王 芃，李山虎，韓 民

（1.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院肝膽外科，貴州貴陽 550001；2.軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所醫(yī)學分子生物學實驗室，北京 100850；3.解放軍總醫(yī)院普外科，北京 100853）

2016年的統(tǒng)計資料顯示，我國肝細胞癌（肝癌）的發(fā)病率約為25.7/10萬，成為死亡率僅次于胃癌和肺癌的第三大惡性腫瘤［1］。目前，手術切除和肝移植仍然是早期肝癌患者最有效的治療手段，但由于約85%患者在診斷時已處于肝癌晚期而失去了手術機會，因此系統(tǒng)性治療在中晚期肝癌患者的治療中扮演著重要角色。但傳統(tǒng)化療方法對于晚期肝癌患者療效不佳，并未表現(xiàn)出生存益處［2］。近年來，腫瘤靶向性藥物治療為肝癌患者提供了新的治療方法，索拉非尼（sorafenib）是目前第一個被證實能改善晚期肝癌患者總生存期的分子靶向藥物，但在臨床研究中也發(fā)現(xiàn)腫瘤對于索拉非尼治療的反應率依然很低，而長期用藥會導致腫瘤細胞轉移性增加，因而迫切需要開發(fā)新的靶向性治療藥物和治療策略［3-4］。

哺乳動物西羅莫司（雷帕霉素）靶蛋白〔mam?malian target of sirolimus（Rapamycin），mTOR〕是一種保守的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，隸屬磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）類家族成員。mTOR分子能感受營養(yǎng)信號、控制細胞內(nèi)mRNA翻譯及蛋白轉運和降解，并在細胞生長、增殖、存活、血管發(fā)生和自噬過程中起到重要的調(diào)控作用［5-6］。研究發(fā)現(xiàn)，40%～50%肝癌患者中mTOR信號通路異常激活，且與腫瘤低分化、預后不良和復發(fā)密切相關［7］。一系列臨床證據(jù)以及臨床前研究均表明，mTOR激酶抑制劑如西羅莫司及其衍生物依維莫司（everolimus）等可用于治療實體瘤如食管鱗狀細胞癌、肺癌、腎細胞癌和前列腺癌等，提示mTOR分子也有可能成為治療肝癌有效的靶標。目前有研究表明，mTOR激酶抑制劑可抑制肝腫瘤細胞的生長和轉移，但是臨床試驗發(fā)現(xiàn)，西羅莫司和依維莫司作為單藥療效非常有限［8-9］，這可能是因為腫瘤細胞中其他信號通路的激活導致產(chǎn)生耐藥性，因而需要在研究耐藥性的基礎上提出聯(lián)合用藥的策略。

目前，已有相關研究發(fā)現(xiàn)，西羅莫司作用前列腺癌、乳腺癌等細胞后會導致PI3K/蛋白激酶B信號通路（PI3K/protein kinase B，PI3K/AKT）的反饋激活［10］而產(chǎn)生耐藥性。本研究旨在探究西羅莫司及其衍生物依維莫司在肝癌細胞中的作用機制，繼而尋找在耐藥現(xiàn)象中發(fā)揮關鍵作用的相關分子，并提出有效的聯(lián)合用藥的策略，為肝癌的臨床治療提供有益的線索。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物、試劑和儀器

肝癌細胞HepG2和BEL-7402為本實驗室保存；西羅莫司、依維莫司、MK2206、和胰島素樣生長因子1受體（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R）抑制劑NVP-AEW541均購自美國Selleck公司；微管蛋白，磷酸化AKT（p-AKT）（Ser473），AKT和p-p70S6K（Thr389）兔多克隆抗體均購自美國Cell Signaling公司；DMEM細胞培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；三羥氨甲烷（Tris）、胰酶和四甲乙二胺（TEMED）均購自美國Sigma公司；依地酸二鈉（乙二胺四乙酸二鈉，ethyl?ene diamine tetraacetic acid，EDTA），十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）和過硫酸銨（ammonium persulfate，AP）均購自上海生工公司；山羊抗兔IgG二抗購自中杉金橋公司；CCK8試劑盒購自東仁化學科技有限公司。細胞培養(yǎng)箱Steri-Cycle CO2Incubator購自美國Thermo公司；冷凍離心機購自德國Eppendorf公司；蛋白電泳及濕轉儀購自美國BioRad公司；EL311SX酶標儀購自美國BioTEK公司；手持式細胞計數(shù)器購自美國Milli?pore公司；SW-CJ-1F超凈工作臺購自蘇州凈化設備有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽購自上海一恒科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

HepG2和BEL-7402細胞用含有10%胎牛血清、50 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 Western蛋白質印法跡檢測AKT，p-AKT和p-p70S6K的表達

將肝癌細胞HepG2和BEL-7402分別接種在60 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至密度為90%作用，用西羅莫司0.1 μmol·L-1和依維莫司0.02 μmol·L-1分別處理細胞0，1，3，6，12和24 h后，收取蛋白樣品；或用依維莫司 0.02 μmol·L-1和 NVP-AEW541 1.0 μmol·L-1或 MK-22061.0 μmol·L-1單獨或聯(lián)合處理細胞24 h后收取蛋白樣品；用BCA比色法檢測蛋白濃度。將蛋白樣品中加入5×SDS加樣緩存液，煮沸10 min，進行SDS-PAGE并濕轉至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉在搖床上封閉30 min，加入（1∶1000）稀釋的一抗后在4℃搖床過夜。用TBST洗膜液洗3次，每次5 min，加入（1∶5000）稀釋的二抗室溫6 h，之后用TBST洗膜3次，每次5 min，在暗室用化學發(fā)光液顯影、定影。Quantity One軟件對蛋白印跡進行積分吸光度（integrated absorbance，IA）分析，蛋白表達水平用IA目標蛋白／IA微管蛋白比值表示。

1.4 CCK8法檢測細胞存活

取生長狀態(tài)良好的HepG2或BEL-7402細胞消化計數(shù)后，以每孔3000個細胞的密度將細胞接種于96孔板，每行3孔，每孔150 μL培養(yǎng)液。第2天待細胞貼壁后，以每孔50 μL的總量將RAD001和MK2206分別或聯(lián)合加入每孔中，終濃度分別為依維莫司 0.02 μmol·L-1和 MK2206 1.0 μmol·L-1，細胞對照組中加入50 μL DMSO。細胞培養(yǎng)72 h后，用真空泵吸干每孔的培養(yǎng)液并在在超凈臺中晾干。以10∶1的比例用DMEM稀釋CCK8試劑，之后每孔加入95 μL稀釋好的CCK8試劑，繼續(xù)將細胞培養(yǎng)板放在CO2培養(yǎng)箱中1.5 h后取出，用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm波長下測定各孔樣品吸光度值（A450nm）值，實驗重復3次。細胞相對存活率（%）=實驗組A450nm/細胞對照組A450nm×100%

1.5 細胞平板克隆形成實驗檢測細胞增殖

取對數(shù)生長期的HepG2和BEL-7402細胞消化計數(shù)后，將細胞懸液按梯度倍數(shù)稀釋后接種于6孔板中，接種密度為每孔4000細胞。待細胞貼壁后，用MK2206 1.0 μmol·L-1和依維莫司 0.02 μmol·L-1單獨或聯(lián)合處理細胞。待在細胞培養(yǎng)箱箱中培養(yǎng)7 d后取出培養(yǎng)皿，移除培養(yǎng)液并用1 mL PBS小心清洗2次，加4%多聚甲醛固定15 min。去固定液后加甲紫（結晶紫）染色30 min。用流水緩慢洗去染色液，放在空氣中干燥。顯微鏡下計數(shù)≥10個細胞的克隆數(shù)，實驗重復3次取均值。

1.6 統(tǒng)計學分析

實驗結果數(shù)據(jù)用x±s表示，利用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析，兩組間比較采用單因素方差分析和t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 西羅莫司和依維莫司對BEL-7402和HepG2細胞中p-70S6K和AKT激酶表達水平的影響

Western蛋白質印跡檢測結果顯示（圖1），用依維莫司0.02 μmol·L-1和西羅莫司0.1 μmol·L-1分別處理肝癌細胞BEL-7402和HepG2后，隨著作用時間的延長，mTOR激酶下游p-p70S6K蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），同時p-AKT表達水平顯著提高（P＜0.05），AKT總蛋白表達水平無顯著改變（數(shù)據(jù)略）。表明在肝癌細胞中mTOR抑制劑可能通過抑制p70S6K激酶的活性引起AKT激酶的反饋激活。

Fig.1 Effect of everolimus（A1，A2，C1 and C2）and sirolimus（B1，B2，D1 and D2）on protein expression of total protein kinase B（t-AKT），phosphorated AKT（p-AKT），and p-p70S6K in BEL-7402（A and B）or HepG2（C and D）cells by Western blotting.The cells were treated with everolimus 0.02 μmol·L-1or sirolimus 0.1 μmol·L-1for 0，1，3，6，12 and 24 h，respectively.IA：integrated absorbance.A2，B2，C2 and D2 were the semi-quantitative results of A1，B1，C1 and D1，respectively.x±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control（0）group.

2.2 依維莫司聯(lián)合NVP-AWE541對HepG2和BEL-7402細胞p-AKT和p-p70S6K激酶表達水平的影響

Western蛋白質印跡檢測結果（圖2）顯示，與細胞對照組相比，依維莫司0.02 μmol·L-1單獨處理HepG2和BEL-7402細胞后，p-p70S6K蛋白表達水平顯著降低的同時p-AKT的表達水平顯著提高（P＜0.01）；NVP-AEW541 1.0 μmol·L-1單獨處理組，HepG2細胞p-AKT、BEL-7402細胞p-AKT和p-p70s6k表達水平顯著降低（P＜0.01）。當NVPAEW541 1.0 μmol·L-1和依維莫司0.02 μmol·L-1聯(lián)合處理2種肝癌細胞后，p-p70S6K蛋白表達水平顯著降低的同時p-AKT表達水平也被顯著抑制（P＜0.01），AKT總蛋白表達水平無顯著改變（數(shù)據(jù)略）。說明抑制IGF-1/IGF-1R信號通路則抑制了依維莫司對AKT激酶的反饋激活。

Fig.2 Effect of everolimus（Evero）and NVP-AEW541（AEW541）combination on protein expression of t-AKT，p-AKT and p-p70S6K in HepG2（A）or BEL-7402（B）cells by Western blotting.The cells were treated with everoli?mus 0.02 μmol·L-1and NVP-AEW541 1.0 μmol·L-1alone or in combination for 24 h.A2 and B2 were the semi-quantitative re?sults of A1 and B1，respectively.x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with everolimus group.

2.3 依維莫司聯(lián)合MK2206對BEL-7402和HepG2細胞AKT激酶水平表達的影響

Western蛋白質印跡結果（圖3）顯示，與細胞對照組相比，MK2206 1.0 μmol·L-1單用可顯著抑制p-AKT表達水平（P＜0.05），而和依維莫司0.02 μmol·L-1聯(lián)合使用后，與依維莫司單獨處理相比顯著抑制了p-AKT的表達水平（P＜0.01），AKT總蛋白表達水平無顯著改變（數(shù)據(jù)略）。表明MK2206可有效抑制依維莫司對肝癌細胞AKT激酶活性的反饋激活功能。

Fig.3 Effect of everolimus（Evero）and MK2206（MK）combination on protein expression of t-AKT and p-AKT in BEL-7402（A）or HepG2（B）cells by Western blot?ting.The cells were treated with everolimus 0.02 μmol·L-1and MK2206 1.0 μmol·L-1alone or in combination for 24 h.A2 and B2 were the semi-quantitative results of A1 and B1，respectively.x ± s，n=3. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with everolimus group.

2.4 依維莫司聯(lián)合MK2206對HepG2和BEL-7402克隆形成和細胞存活的影響

克隆形成實驗（圖4 A1，B1，B2）結果顯示，與單用依維莫司或MK2206相比，依維莫司0.02 μmol·L-1聯(lián)合MK2206 1.0 μmol·L-1處理肝癌細胞7 d，克隆形成數(shù)顯著降低（P＜0.05）。另外CCK-8檢測結果顯示（圖4C1和C2），與細胞對照組相比，依維莫司0.02 μmol·L-1和MK2206 1.0 μmol·L-1單用均能抑制肝癌細胞存活，而依維莫司和MK2206聯(lián)合處理后，顯著增強了單獨用藥下對肝癌細胞生長的抑制作用（P＜0.01）。

Fig.4 Effect of everolimus（Evero）and MK2206（MK）in combination on proliferation of HepG2（A1，B1 and C1）or BEL-7402（A2，B2 and C2）cells detected by plate clone formation assay（A1，A2，B1 and B2）and CCK8（C1 and C2）assay.The cells were treated with everolimus 0.02 μmol·L-1and MK2206 1.0 μmol·L-1alone or in combination for 7 d for plate clone formation assay（A）or 72 h for CCK-8 assay（B），respectively.x±s，n=3. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，#P＜0.01，compared with MK alone group；ΔΔP＜0.01，compared with Evero alone gruop.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，mTOR激酶抑制劑依維莫司和AKT激酶抑制劑MK2206聯(lián)合作用肝癌細胞，可顯著增強單獨用藥下對肝癌細胞生長的抑制作用。

目前只有索拉非尼被證實是能改善晚期肝癌患者總生存期的分子靶向性藥物，因而深入研究新的靶向性藥物以及提出新的治療策略具有非常重要的意義［11］。mTOR信號通路異常與腫瘤的發(fā)生密切相關，因而成為一種有效的腫瘤治療靶點。mTOR激酶抑制劑西羅莫司是一種天然的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，在細胞內(nèi)可與他克莫司（tacrolimus，F(xiàn)K506）結合蛋白12（FKBP12）特異性地結合，形成復合物并作用于mTOR的FRB域從而抑制其活性［12］。西羅莫司的衍生物坦西莫司（temsirolimus）和依維莫司已被FDA和EMA批準用于腎細胞癌、外套細胞淋巴瘤、室管膜下巨細胞細胞瘤和胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的治療［13］。然而，越來越多的臨床報告顯示，西羅莫司及其衍生物在臨床治療當中的效果并不理想，患者會對西羅莫司治療產(chǎn)生耐藥性［14］。

導致西羅莫司及其衍生物產(chǎn)生耐藥性的分子機制之一是其對PI3K/AKT信號通路的反饋激活［16-17］。PI3K/AKT信號通路是mTOR的上游調(diào)控分子，參與細胞代謝、增殖、存活和侵襲等調(diào)控功能［15］?；罨腁KT分子磷酸化并激活下游分子mTOR和核糖體蛋白S6激酶β-1（ribosomal protein S6 kinase beta-1，S6K-β1），反之被激活的S6K-1可抑制PI3K上游調(diào)控分子胰島素受體底物1（insu?lin receptor substrate 1，IRS-1）的功能活性，導致PI3K/Akt通路無法被正常激活，從而形成了一種負反饋抑制環(huán)路［16-17］。西羅莫司及其衍生物抑制mTOR活性后導致S6K-β1無法行使其抑制IRS-1的功能，原本存在的反饋抑制環(huán)路被打破，PI3K/AKT信號通路被激活，繼而腫瘤產(chǎn)生耐藥。

本研究發(fā)現(xiàn)，在西羅莫司和衍生物依維莫司作用下肝癌細胞中的AKT激酶活性明顯被激活，而利用IGF-1R的抑制劑NVP-AEW541有效抑制了依維莫司作用下對AKT激酶的反饋激活，從而提示S6K-β1通過IGF-1/IGF-1R/IRS-1信號通路反饋抑制PI3K/AKT激酶活性。抑制PI3K/AKT通路的反饋激活是目前克服西羅莫司耐藥性的主要研究方向，通過將細胞經(jīng)西羅莫司處理后異常激活的信號通路組分如IGF-1R或AKT的活性加以抑制，即用聯(lián)合用藥的方法可達到更好的抑癌效果［18-19］。Sun等［14］采用PI3K抑制劑LY294002和西羅莫司聯(lián)合用藥處理非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）細胞，發(fā)現(xiàn)對NSCLC的生長和克隆形成能力都有很好的抑制效果；Wan研究組［20］聯(lián)合使用mTOR和IGF-1R抑制劑，發(fā)現(xiàn)增強了單用西羅莫司的臨床治療效果，而本研究中我們使用依維莫司和MK2206聯(lián)合抑制了mTOR激酶和AKT激酶活性，則顯著抑制了肝癌細胞的生長和增殖能力。因而，通過本研究我們初步探索了肝癌細胞對西羅莫司及其衍生物耐藥的分子機制以及聯(lián)合用藥的策略，從而為肝癌患者分子靶向性治療藥物提供了一定的參考。

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