劉 玲，黃紫樂，王建剛

（河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，河南洛陽 471003）

一氧化氮（nitric oxide，NO）是一種親脂性、可擴(kuò)散的分子，其作用的發(fā)揮依賴于NO的濃度和細(xì)胞類型。低濃度NO可抑制細(xì)胞凋亡；然而，高濃度NO可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方式抑制腫瘤細(xì)胞增殖［1］。NO供體是獲得高濃度NO的有效途徑，能在生理狀態(tài)下釋放游離NO或NO類似物，有效補(bǔ)充體內(nèi)NO不足以及恢復(fù)NO正常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均具有良好的抑制活性，還可提高放化療的作用效果。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種結(jié)構(gòu)類型的NO供體，如有機(jī)硝酸酯類、亞硝基硫醇、呋咱氮氧化合物和偶氮鎓二醇鹽等，其中偶氮鎓二醇鹽類在靶向性釋放NO方面優(yōu)勢(shì)明顯［2］。O2-｛2，4-二硝基-5-〔4-（N-甲基氨基）苯甲酰氧基〕苯基｝-1-（N，N-二甲基氨基）偶氮-1-鎓-1，2-二醇（O2-｛2，4-dinitro-5-[4-（N-methylamino）benzoyloxy]phenyl｝1-（N，N-dimethyl?amino）diazen-1-ium-1，2-diolate，PABA/NO）是偶氮鎓二醇鹽的代表化合物之一。Kogias等［3］發(fā)現(xiàn)，PABA/NO可濃度依賴性地抑制人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87增殖，且與替莫唑胺（temozolomide）也有良好的協(xié)同作用；對(duì)于顱內(nèi)腦膠質(zhì)瘤U87裸鼠模型，皮下或瘤內(nèi)給PABA/NO均能顯著抑制腫瘤的生長。研究顯示，PABA/NO衍生物能提高細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，上調(diào)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族中的P38和JNK蛋白，激活胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡［4］。

本研究采用HepG2肝癌細(xì)胞，探究PABA/NO經(jīng)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，為進(jìn)一步闡明PABA/NO誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制及其相應(yīng)信號(hào)通路提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物、試劑和主要儀器

人肝癌HepG2細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)中心保存，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）。PABA/NO按照文獻(xiàn)報(bào)道方式合成［5］（純度≥98%）。用DMSO溶解配制成0.05 mol·L-1濃度的母液，貯存于4℃冰箱備用。臨用現(xiàn)配，DMSO終濃度＜0.1%（V/V）。胰酶（北京索萊寶科技有限公司）；CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；膜聯(lián)蛋白（Annexin）Ⅴ-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（美國BD公司）。羅丹明123（rhodamine123，Rh123）、DAF-FM DA（NO熒光探針）、NO清除劑羧基-PTIO（carboxy-PTIO）、線粒體分離試劑盒、核漿分離試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒（江蘇海門碧云天生物技術(shù)研究所）；兔抗人Bax、Bcl-2、活化胱天蛋白酶3、β肌動(dòng)蛋白、組蛋白H3、細(xì)胞色素c（cytochrome c，Cyt c）和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis inducing factor，AIF）單克隆抗體，以及辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗（均美國Cell Signaling Technology公司）。其他化學(xué)試劑均為分析純。Mini Trans-blot電轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)Clinx Chemi Scope2850（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 細(xì)胞分組和處理

將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，每孔1 mL接種于6孔板中，調(diào)整密度為1.0×109L-1，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后棄上清，將細(xì)胞分為細(xì)胞對(duì)照組（只加等量DMSO，終濃度＜0.01%）和PABA/NO給藥組（7.5，15.0和30.0 μmol·L-1），作用24 h后，每孔含有適宜濃度的含藥培養(yǎng)基（含2%血清，1%雙抗），處理細(xì)胞24 h。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活抑制率

將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，每孔100 μL接種于96孔板中，調(diào)整密度為每孔1×104細(xì)胞，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后棄上清，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組（只加等量DMSO，終濃度＜0.01%）和PABA/NO給藥組（12.5，25.0，50.0，100.0和200.0 μmol·L-1），各組均設(shè)6復(fù)孔，作用24 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37℃孵育2 h后于（美國Bio-Rad公司）450 nm處檢測(cè)吸光度A450nm。細(xì)胞存活抑制率（%）=（細(xì)胞對(duì)照組A450nm-給藥組A450nm）/細(xì)胞對(duì)照組A450nm×100%。

1.4 倒置顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)

取1.2處理的細(xì)胞，藥物作用24 h后直接在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.5 DAF-FM DA熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NO水平

收集1.2處理的細(xì)胞，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入終濃度為 5 μmol·L-1的 DAF-FM DA 1mL，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔5min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用PBS（pH7.4）洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DAF-FM DA。在激發(fā)波長495 nm，發(fā)射波長515 nm用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。用熒光值表示細(xì)胞內(nèi)NO水平。

1.6 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

收集1.2處理的細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗2次，吸取100 μL的細(xì)胞至試管中，加入AnnexinⅤ試劑和PI各5 μL，混勻避光孵育15 min；加入400 μL染色緩沖液，混勻，30 min后流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長535 nm。

1.7 Rh123染色法檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位

收集1.2處理的細(xì)胞，重懸于0.5 mL培養(yǎng)基中，加入終濃度為 10 μmol·L-1的 Rh123 避光孵育20 min，隨即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長507 nm，發(fā)射波長529 nm，用流式細(xì)胞儀分析。

1.8 Western蛋白印跡法檢測(cè)凋亡蛋白表達(dá)

按照1.2處理細(xì)胞，同時(shí)設(shè)carboxy-PTIO 50 μmol·L-1和carboxy-PTIO+PABA/NO 30 μmol·L-1組，carboxy-PTIO加入1 h后再加PABA/NO，繼續(xù)作用24 h，加入含PMSF的裂解液，冰上裂解并收集細(xì)胞，提取線粒體和胞漿蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫下5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗（1∶1000）4℃過夜；二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)拍照成像。利用凝膠成像系統(tǒng)軟件，以目的蛋白吸光度值與內(nèi)參吸光度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以x±s表示，經(jīng)SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，兩組以上均數(shù)的比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PABA/NO對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞生長和形態(tài)的影響

隨著PABA/NO濃度的增加，對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞生長抑制作用逐漸增強(qiáng)。24 h時(shí)IC50值為（10.8±0.6）μmol·L-1。細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞貼壁良好，生長旺盛，呈密集型或重疊生長，大小較一致，形態(tài)規(guī)則（圖1）。隨著PABA/NO濃度的增加，24 h后細(xì)胞生長遲緩，形態(tài)不規(guī)則，胞膜皺縮，細(xì)胞扁圓，部分細(xì)胞脫落懸浮于培養(yǎng)液中。

Fig.1 Effect of nitric oxide（NO）donor，O2-｛2，4-dinitro-5-［4-（N-methylamino）benzoyloxy］phenyl｝1-（N，N-di?methylamino）diazen-1-ium-1，2-diolate（PABA/NO）on morphology of HepG2 cells.HepG2 cells were cultured with PABA/NO for 24 h.

2.2 PABA/NO對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)NO水平的影響

Fig.2 Effect of PABA/NO on level of nitric oxide（NO）in HepG2 cells.See Fig.1 for the cell treatment.FI：fluoresce intensity.x±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control（0）group.

圖2 結(jié)果顯示，與細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)相對(duì)NO水平熒光強(qiáng)度100±3比較，PABA/NO 7.5，15.0和30.0 μmol·L-1作用細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)NO水平顯著提高，熒光強(qiáng)度分別為121±9（P＜0.05），174±31（P＜0.05）和 230±43（P＜0.01），提示 PABA/NO 作為NO供體可在細(xì)胞內(nèi)釋放NO。

2.3 PABA/NO對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響

圖3結(jié)果顯示，與細(xì)胞對(duì)照組比較，PABA/NO 7.5，15.0和30.0 μmol·L-1作用細(xì)胞24 h后，HepG2細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.01），說明PABA/NO明顯誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。

2.4 PABA/NO對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞線粒體膜電位的影響

圖4 結(jié)果顯示，與對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)Rh123的熒光強(qiáng)度668±69比較，PABA/NO7.5，15.0和30.0μmol·L-1作用細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)Rh123的熒光強(qiáng)度下降到605±73，420±65（P＜0.05）和 242±47（P＜0.01），提示PABA/NO可使HepG2細(xì)胞線粒體膜電位下降。

2.5 PABA/NO對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

與細(xì)胞對(duì)照組相比，PABA/NO作用HepG2后，隨著濃度的增加，細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2明顯下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），促凋亡蛋白Bax上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），Bax/Bcl-2比值由對(duì)照組0.24±0.01升高到0.53±0.05，1.38±0.33和4.82±0.30，活化胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.01）（圖5A1和圖5A2）。胞漿中Cyt c的表達(dá)增加（P＜0.01）（圖5B1和圖5B2）；胞核中AIF的表達(dá)增加（P＜0.01）（圖5C1和圖5C2），提示PABA/NO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與激活線粒體通路有關(guān)。

Fig.4 Effect of PABA/NO on mitochondrial membrane potential in HepG2 cells.See Fig.1 for the cell treatment.

2.6 carboxy-PTIO對(duì)PABA/NO作用的影響

與單用PABA/NO比較，加入NO清除劑carboxy-PTIO后，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加（P＜0.01），而促凋亡蛋白Bax表達(dá)下調(diào)（P＜0.01），Bax/Bcl-2比值由3.90±0.45降低到1.32±0.06（P＜0.01），活化胱天蛋白酶3的表達(dá)下調(diào)（P＜0.01）（圖6A1，圖6A2和圖6B2）。與單用PABA/NO比較，加入NO清除劑carboxy-PTIO后，胞漿中Cyt c的表達(dá)出現(xiàn)了明顯下調(diào)（P＜0.01）（圖6B1和圖6C2）；細(xì)胞核內(nèi)AIF蛋白的表達(dá)也明顯下調(diào)（P＜0.01）（圖6C1和圖6C2），提示PABA/NO可能通過釋放NO激活線粒體通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

Fig.5 Effect of PABA/NO on expressions of Bcl-2，Bax，cleaved caspase 3（A1 and A2），cytochrome c（Cyt c）（B1，B2）and apoptosis inducing factor（AIF）（C1 and C2）protein in HepG2 cells.See Fig.1 for the cell treatment.A2，B2 and C2 were the semi-quantitative results of A1，B1 and C1，respectively.x±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control（0）group.

Fig.6 Effect of carboxy-PTIO on expressions of Bcl-2，Bax，cleaved caspase3（A1 and A2），Cyt-c（B1 and B2）and AIF（C1 and C2）protein in PABA/NO treated HepG2 cells for 24 h.A2，B2 and C2 were the semi-quantitative results of A1，B1 and C1，respectively.Carboxy-PTIO 50 μmol·L-1was added 1 h before PABA/NO 30 μmol·L-1treatment.x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with PABA//NO group.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，PABA/NO 7.5～30.0 μmol·L-1作用24 h后，對(duì)HepG2細(xì)胞存活具有明顯的抑制作用，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)扁圓、胞膜皺縮等明顯的變化。NO熒光探針檢測(cè)到PABA/NO可在細(xì)胞內(nèi)釋放較高水平的NO。另外，PABA/NO還可顯著誘導(dǎo)人HepG2細(xì)胞凋亡，降低線粒體膜電位，改變凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。研究顯示，PABA/NO作為一種較為新型的偶氮鎓二醇鹽衍生物，可在GSTπ作用下釋放NO，產(chǎn)生較高濃度的NO，通過增加細(xì)胞內(nèi)外源性NO水平抑制腫瘤細(xì)胞增殖［6-7］。

AnnexinⅤ-FITC/PI雙染結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PABA/NO作用HepG2細(xì)胞后凋亡率顯著升高。Rh123熒光探針檢測(cè)線粒體膜電位結(jié)果顯示，PABA/NO可顯著降低線粒體膜電位，提示PABA/NO可引起線粒體損傷，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果顯示，PABA/NO可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，引起抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，而促凋亡蛋白Bax上調(diào)，Bax與Bcl-2的比值升高，從而使線粒體膜的通透性發(fā)生改變。促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加，可使線粒體結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生紊亂，引起細(xì)胞器腫脹和跨膜電位丟失等，最終受損的線粒體開放通透性轉(zhuǎn)換孔。一旦線粒體外膜和內(nèi)膜通透性發(fā)生改變，會(huì)從線粒體中釋放并活化分解代謝的水解酶（包括胱天蛋白酶類）。這些水解酶可終止線粒體的生物能量和氧化功能，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這意味著線粒體可協(xié)調(diào)細(xì)胞死亡的最后階段［8］。胱天蛋白酶是細(xì)胞凋亡通路上的關(guān)鍵酶之一。本研究結(jié)果顯示，PABA/NO作用于HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞中活化胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，說明PABA/NO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與該通路激活有關(guān)。

一些釋放到線粒體膜外的可溶性蛋白，如Cyt c和AIF可激活胱天蛋白酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路。本研究結(jié)果顯示，PABA/NO能明顯上調(diào)細(xì)胞核內(nèi)AIF蛋白的表達(dá)，即AIF發(fā)生了核轉(zhuǎn)運(yùn)，胞漿中Cyt c表達(dá)增加，提示Cyt c從線粒體釋放到了胞質(zhì)中，提示PABA/NO可引起受損的線粒體開放通透性轉(zhuǎn)換孔，從而釋放Cyt c和AIF。Cyt c釋放到胞質(zhì)中與凋亡蛋白激活因子（apoptosis protease activating factor-1，Apaf-1）結(jié)合是凋亡進(jìn)程中的一個(gè)關(guān)鍵步驟。Apaf-1與Cyt c結(jié)合后使其與dATP的親和力增加，利于召集和形成凋亡復(fù)合體。凋亡復(fù)合體通過招募大量胱天蛋白酶9前體，并促進(jìn)其剪切形成活化胱天蛋白酶9，隨后胱天蛋白酶9可作為剪切因子活化胱天蛋白酶3，后者是執(zhí)行凋亡的關(guān)鍵蛋白，進(jìn)而激活下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)生凋亡［9］。而AIF可轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)參與不依賴胱天蛋白酶的染色質(zhì)溶解。AIF是線粒體蛋白的一種，當(dāng)一些細(xì)胞凋亡因子作用后，AIF被蛋白酶剪切成57 ku的AIF片段，從細(xì)胞膜上的錨定位點(diǎn)脫離。隨著線粒體外膜通透性增加，這個(gè)片段可從線粒體膜間隙中釋放到胞質(zhì)中。由于AIF具有2個(gè)核定位信號(hào)，所以一旦它釋放到胞質(zhì)中，即可轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中，從而激活可水解細(xì)胞核DNA的核酸內(nèi)切酶，發(fā)生大范圍的DNA片段化以及染色質(zhì)凝集［10］。隨后與AIF結(jié)合后形成凋亡復(fù)合體，后者促進(jìn)胱天蛋白酶3前體形成活化胱天蛋白酶3，發(fā)揮促凋亡作用。另外，本研究結(jié)果顯示，NO清除劑carboxy-PTIO可逆轉(zhuǎn)PABA/NO對(duì)上述相關(guān)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，如上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白Bax蛋白表達(dá)，活化胱天蛋白酶3表達(dá)降低，同時(shí)釋放到胞漿中的Cyt c表達(dá)降低，胞核中AIF表達(dá)也下降，提示PABA/NO誘導(dǎo)凋亡蛋白的改變與其釋放NO有關(guān)。

綜上所述，PABA/NO能抑制肝癌細(xì)胞增殖，通過降低線粒體膜電位，使Bax與Bcl-2的比值升高，促使Cyt c和AIF的釋放，前者激活胱天蛋白酶途徑，后者進(jìn)入細(xì)胞核使DNA片段化，最終誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞經(jīng)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

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