（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110013）

死后生物化學(xué)檢查是法醫(yī)學(xué)鑒定中重要的檢查手段[1-4]。肌酐是臨床上常用的生化學(xué)檢測(cè)指標(biāo)，也是反映代謝紊亂和腎功能的主要指標(biāo)，對(duì)法醫(yī)學(xué)應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。而肌酐的中間代謝產(chǎn)物1-甲基海因（1-methylhydantoin，1-MH）是新近發(fā)現(xiàn)的尿毒癥毒素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。有研究[5-8]表明，尿毒癥患者血中1-甲基海因明顯高于正常人，且1-甲基海因?yàn)榧?xì)菌分解肌酐后的產(chǎn)物，可結(jié)合肌酐、尿素氮含量評(píng)價(jià)腎功能，故其也可作為生化學(xué)檢測(cè)物質(zhì)應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)鑒定。有報(bào)道[9]采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)蛤蟆油中1-甲基海因進(jìn)行測(cè)定，而血中1-甲基海因含量測(cè)定少有報(bào)道。本研究擬采用氣相色譜-質(zhì)譜（GCMS）法測(cè)定血中1-甲基海因含量，以期對(duì)相關(guān)領(lǐng)域工作提供參考。

圖1 肌酐（A、B）及1-甲基海因（C）化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

7890B-5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）。

1-甲基海因標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海一研生物科技有限公司，純度＞99.5%。鹽酸雙苯戊二氨酯（SKF525A）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，純度＞95%。甲醇為色譜純，環(huán)己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷均為分析純。

1.2 溶液配制

1-甲基海因標(biāo)準(zhǔn)液：精密稱取10 mg 1-甲基海因標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為1mg/mL的溶液。 然后用蒸餾水逐級(jí)稀釋為 50、10、5、1、0.5 ng/mL的1-甲基海因標(biāo)準(zhǔn)溶液。

內(nèi)標(biāo)SKF525A溶液：準(zhǔn)確稱取SKF525A標(biāo)準(zhǔn)品10mg置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻，得1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，然后用甲醇稀釋為100 μg/mL的工作液。

1.3 方法

1.3.1 儀器條件

選用 Rtx-5 色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），初始柱溫60℃，保持1min，以20℃/min升溫至260℃，保持11min，總分析時(shí)間為22min。進(jìn)樣口溫度265℃，接口溫度260℃，離子源溫度230℃。掃描范圍m/z 35～450。載氣為氦氣，流速1.0mL/min，采用電子轟擊式離子源。

1.3.2 樣品前處理

取待測(cè)血液0.5mL，加入5μL內(nèi)標(biāo)、2mL 0.01mol/L稀鹽酸溶液，振蕩2min，再加入碳酸銨0.5g調(diào)節(jié)pH值為9。加入2mL乙酸乙酯，振蕩2min，之后以離心半徑5cm，4000r/min，離心10min。吸取上層有機(jī)溶劑，用氮?dú)獯蹈芍?00μL。取1μL用于GC-MS進(jìn)樣。

1.3.3 工作曲線、最低檢出限、線性范圍

按1.3.2節(jié)操作，每份樣品平行測(cè)定3次，以1-甲基海因的質(zhì)量濃度為自變量（x），1-甲基海因與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為因變量（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以信噪比的2倍為最低檢出限，以信噪比的10倍為最低定量限[10]。

1.3.4 精密度和回收率

取添加1-甲基海因低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（分別為 0.5、5、50 ng/mL）的血液，按照 1.3.2 節(jié)處理，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)提取3次，計(jì)算每個(gè)質(zhì)量濃度樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）作為日內(nèi)精密度。連續(xù)測(cè)定5d，計(jì)算每個(gè)質(zhì)量濃度樣品的RSD作為日間精密度。

2 結(jié) 果

2.1 GC-MS檢測(cè)

1-甲基海因和內(nèi)標(biāo)得到了很好的分離，色譜峰尖銳。血液中1-甲基海因和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為6.922min 和 13.279min（圖 2）。

圖2 血液中1-甲基海因和內(nèi)標(biāo)的GC-MS圖

2.2 工作曲線、線性范圍和最低檢出限

結(jié)果顯示，1-甲基海因在0.5～50ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=0.015 51 x+0.007 26（R2=0.9997），最低檢出限為 0.1ng/mL。

2.3 精密度和回收率

1-甲基海因的精密度和回收率結(jié)果見表1。

表1 1-甲基海因的精密度和回收率 （%）

2.4 案例應(yīng)用

楊某，男，41歲，被人攻擊頭部死亡。尸表檢查：瞳孔散大，面部左側(cè)散在點(diǎn)片狀淡紅色皮下出血，右額部片狀淡紅色皮下出血。尸體解剖：切開頭皮見帽狀腱膜下20cm×22cm范圍廣泛出血，左側(cè)顳肌4cm×5 cm范圍出血，左顳頂部7 cm×10 cm范圍呈粉碎性骨折，頂部有一骨折線，向右顳部延伸，長(zhǎng)10cm；鋸開顱骨見左顳部硬腦膜破裂，硬腦膜下血腫達(dá)14 cm×9 cm×6 cm，蛛網(wǎng)膜下腔出血；腎表面凹凸不平，包膜難以剝離，切面皮髓質(zhì)分界不清，皮質(zhì)明顯萎縮、變薄，雙腎實(shí)質(zhì)內(nèi)多個(gè)細(xì)小囊腫，直徑最大為3 mm，未見挫傷及結(jié)石。組織病理學(xué)檢驗(yàn)：較多腎小球纖維化，鄰近的腎小管萎縮、消失，間質(zhì)纖維組織增生，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，存活的腎小球及腎小管代償性肥大，部分區(qū)域可見血腫及漿液性囊腫結(jié)構(gòu)。死者生前生化檢驗(yàn)結(jié)果顯示血肌酐 1 756 μmol/L，尿素氮 76.3 mmol/L，是名尿毒癥患者。經(jīng)本研究建立的方法從血樣中檢測(cè)出1-甲基海因，含量為8.78ng/mL。

3 討 論

3.1 萃取環(huán)境的考察

本研究前期考察了pH=2（0.01 mol/L稀鹽酸溶液）、pH=7（pH=7 的蒸餾水溶液）、pH=9（0.01mol/L 稀鹽酸溶液，振蕩2 min，加入0.5g碳酸銨調(diào)節(jié)pH值為 9）、pH=12（0.01 mol/L的氫氧化鈉溶液）情況下的萃取情況，結(jié)果顯示在pH=9的條件下萃取效率最高?？赡苁怯捎?-甲基海因?qū)儆谏飰A，雖然其結(jié)構(gòu)中有酰亞胺結(jié)構(gòu)，但整體呈弱堿性。

3.2 萃取溶劑的考察

本研究前期考察了3種萃取溶劑，按照極性大小依次為二氯甲烷、乙酸乙酯、環(huán)己烷，其中乙酸乙酯作為萃取溶劑時(shí)，萃取效率最高。由于1-甲基海因?qū)儆谥械葮O性物質(zhì)，所以依據(jù)相似相溶原理，中等極性的萃取溶劑乙酸乙酯相對(duì)理想。

3.3 結(jié)論

肌酐具有一定的穩(wěn)定性，是臨床上用于評(píng)價(jià)腎功能的主要指標(biāo)，尿毒癥患者會(huì)出現(xiàn)肌酐含量升高。而1-甲基海因是肌酐代謝的中間產(chǎn)物，由肌酐在尿毒癥患者的胃腸道內(nèi)經(jīng)過肌酐脫氨酶形成后再進(jìn)入人體[11]，因1-甲基海因在正常組織中檢測(cè)不到，在炎癥組織中可檢測(cè)到[12]，故可結(jié)合肌酐、尿素氮含量評(píng)價(jià)腎功能。本案中，該名死者存在腎病，肌酐含量高于正常值（44～133 μmol/L），亦在死者血樣中檢測(cè)出肌酐的代謝產(chǎn)物1-甲基海因，所以1-甲基海因的測(cè)定對(duì)尿毒癥患者相關(guān)法醫(yī)學(xué)鑒定具有一定的指導(dǎo)意義。

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