（南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 江蘇省人民醫(yī)院司法鑒定所，江蘇 南京 210029）

插入/缺失（insertion/deletion，InDel）位點兼具法醫(yī)學常見遺傳標記STR基因座和SNP位點的優(yōu)點，在法醫(yī)學研究中引起了學者的關注。在醫(yī)學領域，一些InDel位點和腫瘤、遺傳性疾病也具有相關性。該類遺傳標記特性類似SNP位點，為二等位遺傳標記，突變率低，約為10-8，是理想的補充遺傳標記[1-3]。本研究主要針對江蘇地區(qū)漢族人群展開，在既往用STR基因座[4-5]進行遺傳學分析的基礎上，運用InDel遺傳標記物對該地區(qū)人群進行法醫(yī)遺傳學研究，以期獲得相關數據，為鑒定實踐及后續(xù)科研工作積累可靠依據。

1 材料與方法

1.1 樣本

本研究共涉及305名漢族健康志愿者的血樣，均采集于江蘇地區(qū)，其中男性199名，女性106名。實驗前對每名志愿者進行風險告知，并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

Investigator?DIPplex試劑盒（德國QIAGEN公司），甲酰胺（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

SimpliAmpTM熱循環(huán)儀、3130基因分析儀（美國AB公司）。

1.3 PCR擴增和測序分型

采用Chelex-100法進行血樣DNA的提取[6]。采用12.5 μL體系對試劑盒中包含的30個InDel位點進行PCR擴增，反應體系包括：2.5 μL反應緩沖液，2.5 μL引物混合物和0.3 μL DNA聚合酶，其余體積由模板DNA（0.5～2ng）及去離子水補齊。反應緩沖液中主要成分為dNTP、MgCl2和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）。PCR 條件為：預變性 94℃ 4min；94℃ 30 s，61℃ 120 s，72℃ 75 s，30 個循環(huán)；68℃延伸60min；10℃保溫。PCR產物變性后在3130基因分析儀上進行毛細管電泳，用GeneMapper?ID v3.2.1軟件對InDel位點進行分型。

1.4 統計學處理

采用SNPAnalyzer v2軟件對試劑盒中涉及的30個InDel位點進行Hardy-Weinberg平衡檢驗、頻率數據統計、連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）、三聯體非父排除率（PEtrio）和二聯體非父排除率（PEduo）分析。采用PowerStats v12軟件統計分析30個InDel位點的多態(tài)信息含量（PIC）、個體識別率（DP）和雜合度（H）。收集國內公開發(fā)表數據[7-12]進行整理、分析，采用 Genepop v4.2（http://www.genepop.curtin.edu.au）提供的方法計算獲得人群間的遺傳分化系數（genetic differentiation coefficient F-statistics，Fst）及遺傳距離。

2 結 果

2.1 等位基因分型結果

在305份江蘇地區(qū)漢族無關個體血樣中，Investigator?DIPplex試劑盒中的30個InDel位點均可以得到有效擴增，擴增片段長度為75～160bp，峰高穩(wěn)定在 1000～5000RFU。

2.2 等位基因頻率和相關遺傳學參數

30個InDel位點均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05），相關的遺傳學信息見表 1。

2.3 連鎖不平衡分析結果

經SNPAnalyzer v2軟件分析后發(fā)現，該試劑盒含有的30個InDel位點之間相互獨立。采用乘積定律計算，累積個體識別率為1-7.369×10-8，二聯體累積非父排除率為0.998933978，三聯體累積非父排除率為0.997806392。

2.4 與其他地域漢族群體之間遺傳距離分析

通過缺失頻率進行7個漢族人群之間的Fst值比較和遺傳距離計算結果見表2～3。

表1 30個InDel位點在江蘇漢族人群中的遺傳學信息 （n=305）

表1 （續(xù)）

表2 7個漢族人群的缺失頻率相比獲得的Fst值

表3 7個漢族人群之間的遺傳距離

3 討 論

Investigator?DIPplex試劑盒是目前市場上推出的第一個成熟化的InDel位點檢測試劑盒，共包含30個常染色體InDel位點[1-3]。這一類遺傳標記為長度多態(tài)性遺傳標記，可以在法醫(yī)學常用檢測平臺——遺傳分析儀（310、3130、3130xl、3500 及 3500xl型）上完成檢測，易于在各個法醫(yī)物證實驗室推廣，無需增購設備。針對這一商業(yè)化檢測試劑盒，目前已有華東漢族與畬族[7]、廣東漢族[8]、河南漢族[9]、北京漢族[10]、廣西漢族與苗族[11]、中國漢族[12]等人群數據。但介于人群之間可能存在的遺傳距離差異以及總結江蘇地區(qū)InDel位點遺傳信息的必要性，本研究針對305名江蘇地區(qū)長期居住的漢族無關個體進行了較細致的統計分析。

本研究的30個InDel位點分布在19個常染色體上，結果顯示等位基因頻率為0.049～0.951，各位點PIC 為 0.089～0.375，DP 為 0.093～0.500，H 為0.094～0.502，30個InDel位點的累積個體識別率為1-7.369×10-8，二聯體累積非父排除率為0.998933978，三聯體累積非父排除率為0.997806392。HLD118（rs16438）的最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）小于 0.1，5 個 InDel位點 （HLD111、HLD99、HLD64、HLD81、HLD39）的 MAF 在 0.1～0.2，3 個 InDel位點（HLD114、HLD122、HLD84）的 MAF 在 0.2～0.3，其余21個InDel位點的MAF均大于0.3。

30個InDel位點在本研究人群中均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05），說明江蘇漢族群體在符合隨機采樣的情況下，群體中各個體的基因比例（頻率）可從一代傳到另一代且維持不變，保持遺傳的平衡穩(wěn)定性，本次樣本隨機性和采集數目符合統計學要求。30個InDel位點經連鎖不平衡分析，各位點之間相互獨立，如HLD83、HLD84兩個位點均處于8號染色體，HLD40、HLD128和 HLD39 3個位點均處于1號染色體，亦不存在連鎖不平衡現象。

通常來講，MAF的理想狀態(tài)應位于0.3～0.7，但本研究中HLD118（rs16438）位點MAF值最小，為0.049，小于廣東（0.080）[8]、北京（0.0857）[10]、廣西（0.100）[11]漢族人群，更接近于胡真等[7]總結的結果（0.0628），但都普遍較低，說明該基因座在已有統計的中國漢族人群中多態(tài)性分布較差，不適合中國人群。而MAF在0.1～0.3的8個位點與已報道[7-12]的人群保持相同范圍?？赡苁且驗樵撛噭┖形稽c主要基于德國人群，并非面向中國人群，造成遺傳學參數均衡性及多態(tài)性相對較差。

Fst是指特定基因座在群體間的分布差異程度。Fst值越小，說明變異程度越小。有學者[13]認為，通過群體計算得到的Fst值小于0.06可保證所選擇的位點適用于不同的群體，從而得到穩(wěn)定的個體識別效力。本研究 Fst值小于 0.06的有 HLD77、HLD45、HLD131等25個位點，絕大部分在所關注的國內7個漢族人群中不存在分化情況。另外，Fst值大于0.06的有HLD111、HLD118、HLD64、HLD81、HLD39 共 5 個位點，說明上述5個位點在不同群體中的基因頻率差異性較大。

對不同地域群體間的Fst遺傳距離進行兩兩比較，發(fā)現：江蘇漢族和廣西漢族的距離最遠（0.0871），與華東漢族的距離最近（0.0247）；河南漢族和北京漢族（0.038 5）、中國漢族（0.030 6）距離最近；廣西漢族和除廣東漢族外的其他地域漢族人群距離都相對較遠（＞0.0733）。說明遺傳距離和地域實際的物理距離區(qū)分度相似，人群在長年的遷徙過程中正逐步發(fā)生變化。同時，InDel作為遺傳標記物，以等位基因頻率計算遺傳距離可用于群體遺傳學的研究。

但考慮到30個InDel位點的累積個體識別率、二聯體累積非父排除率、三聯體累積非父排除率均低于13 個CODIS STR 分型試劑的效能（0.999 999 992）[8]，Investigator?DIPplex試劑盒所包含的30個InDel位點可以作為必要的補充遺傳標記，在高度腐敗、小分子量片段及腫瘤組織等疑難檢材的鑒定分析中發(fā)揮作用，為相關法醫(yī)物證案件及疾病遺傳基因突變靶點確認提供遺傳學數據支持。

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