王昌亮 ，夏志秀 ，張國(guó)華 ，尤家斌 ，于 浩 ，王林林 ，張孟周 ，楊洪波 ，谷建平 ，靳彥奎

（1．遼寧省人民檢察院，遼寧 沈陽(yáng) 110032；2．中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110122；3．中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110004；4.河北省人民檢察院，河北 石家莊 054002；5．最高人民檢察院技術(shù)信息中心，北京 100144）

肝是人體最大的實(shí)質(zhì)性器官，因位置相對(duì)固定，質(zhì)地脆弱，血運(yùn)豐富，在交通肇事和暴力事件中非常容易受到撞擊而導(dǎo)致?lián)p傷破裂。據(jù)報(bào)道[1-2]，肝破裂的死亡率可高達(dá)54%。真性肝破裂后較快出現(xiàn)癥狀與體征，傷者多因急性腹腔內(nèi)大出血而死亡[3]。有時(shí)肝在受到直接或間接外力作用后，實(shí)質(zhì)挫傷，表現(xiàn)為被膜下或?qū)嵸|(zhì)中央出血，當(dāng)腹部再次遭受外力作用或其他誘因時(shí)，可在數(shù)小時(shí)至數(shù)天后發(fā)生遲發(fā)性破裂而死亡[4]。法醫(yī)學(xué)鑒定中，明確肝損傷與死亡之間的關(guān)系有利于判斷案件性質(zhì)以及對(duì)嫌疑人責(zé)任的認(rèn)定，但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于鈍性外力造成肝挫傷的損傷時(shí)間推斷研究較少，屬于法醫(yī)學(xué)鑒定中的一個(gè)難題。

肝損傷后的不同階段會(huì)有諸多生物因子參與其炎癥和修復(fù)過(guò)程，包括生長(zhǎng)因子、黏附因子、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等[5]。 MMP-2和MMP-9是MMP家族中的兩個(gè)重要成員，存在于包括肝在內(nèi)的許多器官和組織中，主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)，在損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[6]。鑒于已有學(xué)者[7-9]將MMP-2和MMP-9作為腦損傷和皮膚損傷時(shí)間推斷的參考指標(biāo)，本研究擬通過(guò)建立大鼠撞擊性肝挫傷模型，運(yùn)用免疫組織化學(xué)和Western印跡法觀察肝挫傷后不同時(shí)間MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)情況，以期為肝挫傷的損傷時(shí)間推斷提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

兔抗大鼠MMP-2多克隆抗體（ab110186）、兔抗大鼠MMP-9多克隆抗體（ab38898）和兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體（ab9485）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG（ZB2301）、SP 試劑盒（SP9001）及DAB顯色液均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

RM2235石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司），ELx808酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司），5500全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司），立體垂直定位打擊器（瑞沃德生命科技有限公司）。

1.2 動(dòng)物分組與及模型建立

健康雄性SD大鼠50只，質(zhì)量340～360g，隨機(jī)分為對(duì)照組和傷后 1h、3h、6 h、12h、18h、24 h、3 d、5 d、7d組，共10組，每組5只大鼠。

實(shí)驗(yàn)組大鼠在禁食12h后，用4%水合氯醛溶液以0.5mL/100g腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥于操作臺(tái)，利用立體垂直定位打擊器，參照陸明等[10]大鼠肝撞擊模型制作方法，選擇質(zhì)量100g、直徑5mm的打擊錘，通過(guò)定位管從120cm高處垂直落下，撞擊大鼠劍突與右側(cè)肋弓夾角處，在損傷后上述時(shí)間點(diǎn)處死大鼠。解剖見(jiàn)大鼠肝被膜下血腫或淺表挫裂創(chuàng)，測(cè)量損傷區(qū)的長(zhǎng)軸與短軸，計(jì)算損傷面積。提取損傷的肝葉并于挫傷區(qū)中心將其縱行分為兩部分，一部分用于HE染色和免疫組織化學(xué)染色，另一部分剔除損傷周邊正常肝組織，僅將挫傷組織經(jīng)生理鹽水清洗后速凍，用于Western印跡法檢測(cè)。對(duì)照組直接提取肝中葉進(jìn)行相同處理。

1.3 方法

1.3.1 HE染色

將提取的肝組織用4%多聚甲醛溶液固定24 h后，經(jīng)脫水、透明等程序，制成蠟塊，制作5μm厚度切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色

采用鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶連接法（SP法），以兔抗大鼠MMP-2和兔抗大鼠MMP-9多克隆抗體（1∶200）作為一抗，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。DAB顯色，顯微鏡下以胞質(zhì)、胞膜及細(xì)胞間質(zhì)著黃色或棕黃色為陽(yáng)性。

1.3.3 Western印跡法

將對(duì)照組和傷后各組肝組織經(jīng)液氮速凍并研磨后，加入裂解液，勻漿后在4℃下，以離心半徑6 cm，12000r/min，離心10min，提取上清液。采用BCA法，應(yīng)用ELx808酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白濃度，配制等量蛋白上樣緩沖液，經(jīng)電泳和轉(zhuǎn)印，將蛋白轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用 8%牛奶封閉2 h，在目的蛋白所在區(qū)域分別加入兔抗大鼠MMP-2 和兔抗大鼠 MMP-9 多克隆抗體（1∶1000），4℃過(guò)夜，經(jīng)山羊抗兔辣根酶標(biāo)記二抗（1∶5000）孵育2h，以上各步驟間均用TBST洗膜5 min×3次，滴加發(fā)光液。在5500全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)發(fā)光顯色，同時(shí)以 GAPDH（1∶5000）作為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

免疫組織化學(xué)染色圖像于400倍顯微鏡下，在每張切片挫傷區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)測(cè)量視野，利用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率，并用GraphPad Prism 5.0軟件分析，以±s表示。

Western印跡法中利用Image J軟件計(jì)算MMP-2、MMP-9和 GAPDH的灰度值，分別將MMP-2和MMP-9與對(duì)應(yīng)GAPDH灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，用GraphPad Prism 5.0軟件分析，以±s表示。

采用單因素方差分析和Bonferroni法對(duì)傷后各組與對(duì)照組之間以及各組與相鄰上組之間數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩分析比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 肝挫傷的病理學(xué)改變

解剖各組大鼠，見(jiàn)挫傷多在肝中葉中下部，損傷面積為 0.45～0.82cm2。傷后 1～6h，見(jiàn)挫傷區(qū)被膜下血腫，切面出血；傷后12～24h，挫傷區(qū)表面及切面均呈乳白色；傷后3～7 d，損傷區(qū)表面及切面呈白色，切面質(zhì)地由脆逐漸轉(zhuǎn)韌。

HE染色見(jiàn)傷后1～6 h以出血、血腫為主；傷后12 h～3 d挫傷區(qū)紅細(xì)胞逐漸被吸收，肝細(xì)胞壞死，細(xì)胞核碎裂，可見(jiàn)大量以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，其中含少量巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞；傷后5～7d挫傷區(qū)被纖維組織替代，出現(xiàn)大量成纖維細(xì)胞，同時(shí)出現(xiàn)許多新生的小膽管和小血管。

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

2.2.1 MMP-2的表達(dá)情況

對(duì)照組MMP-2主要在血管內(nèi)皮及其周?chē)渭?xì)胞內(nèi)表達(dá)；傷后1～3 h挫傷區(qū)邊緣散在出現(xiàn)MMP-2陽(yáng)性細(xì)胞；傷后6 h陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加；傷后12 h挫傷區(qū)內(nèi)表達(dá)明顯增強(qiáng)，并可見(jiàn)少量胞質(zhì)濃染的單核細(xì)胞；傷后18～24 h達(dá)到高峰，挫傷區(qū)內(nèi)陽(yáng)性表達(dá)呈彌漫性分布，部分中性粒細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)也有表達(dá)；傷后3 d，MMP-2表達(dá)減弱，挫傷區(qū)邊緣肝細(xì)胞表達(dá)較強(qiáng)，部分成纖維細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)弱表達(dá)；傷后5d陽(yáng)性表達(dá)明顯減少，僅在新生區(qū)域部分肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；傷后7 d，MMP-2僅在新生區(qū)域部分竇內(nèi)皮和少數(shù)肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)（圖 1）。

圖1 MMP-2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 SP×200

除傷后1 h和7 d組陽(yáng)性細(xì)胞率與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）外，其余傷后各組與對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；傷后 6 h～7d各組與相鄰上組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表 1）。

2.2.2 MMP-9的表達(dá)情況

對(duì)照組MMP-9主要在中央靜脈周?chē)渭?xì)胞和庫(kù)普弗細(xì)胞表達(dá)；傷后1～3h挫傷區(qū)及周邊肝細(xì)胞和肝竇內(nèi)MMP-9表達(dá)開(kāi)始增強(qiáng)，在部分中性粒細(xì)胞內(nèi)開(kāi)始表達(dá)；傷后6～12h挫傷區(qū)表達(dá)明顯增強(qiáng)，范圍擴(kuò)大到損傷區(qū)外，細(xì)胞間隙內(nèi)出現(xiàn)陽(yáng)性顆粒；傷后18 h達(dá)到高峰，中性粒細(xì)胞和肝細(xì)胞內(nèi)均高表達(dá)，挫傷區(qū)域周邊出現(xiàn)大量陽(yáng)性顆粒；傷后24h相比18h表達(dá)略減弱；傷后3d，MMP-9表達(dá)減弱，細(xì)胞間隙陽(yáng)性顆粒減少，壞死區(qū)域內(nèi)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)；傷后5～7d，MMP-9主要在挫傷區(qū)新生膽管上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)（圖 2）。

傷后各組陽(yáng)性細(xì)胞率與對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各組（除 7d 組）與相鄰上組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表 1）。

表1 MMP-2和MMP-9的陽(yáng)性細(xì)胞率比較

圖2 MMP-9免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 SP×200

2.3 Western印跡法檢驗(yàn)結(jié)果

由表2可見(jiàn)：MMP-2蛋白表達(dá)在傷后1～3 h緩慢升高，6～18 h表達(dá)逐漸增強(qiáng)，24 h達(dá)到峰值，3～5 d表達(dá)下降，7 d已接近正常水平；除傷后1 h和7 d組外，其余傷后各組與對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；除傷后 18 h組外，損傷 6 h后各組與相鄰上組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MMP-9蛋白表達(dá)在傷后1h即開(kāi)始明顯升高，隨時(shí)間呈逐漸遞增的趨勢(shì)，18～24 h達(dá)到高峰，3～5 d表達(dá)回落，7d仍高于正常水平；傷后各組與對(duì)照組進(jìn)行比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；除傷后 12 h、24 h組外，各組與相鄰上組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MMP-2和MMP-9蛋白在對(duì)照組和傷后各組均有表達(dá)（圖3）。

表2 MMP-2和MMP-9蛋白的相對(duì)表達(dá)量

圖3 大鼠肝挫傷后MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)變化

3 討 論

MMP是一組Ca2+-Zn2+依賴(lài)性?xún)?nèi)肽酶，以無(wú)活性的酶原形式分泌，激活后形成瀑布效應(yīng)，幾乎能降解所有的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），在胚胎發(fā)育、血管形成、組織修復(fù)、細(xì)胞脫落及遷移中起著至關(guān)重要的作用[11]。目前已發(fā)現(xiàn)25種MMP，分為膠原酶、明膠酶、間質(zhì)溶解酶、基質(zhì)溶酶和膜型蛋白酶五類(lèi)[11]。MMP-2和MMP-9又稱(chēng)明膠酶Ⅳ，酶原相對(duì)分子質(zhì)量分別為72000和92000，是MMP家族中的兩個(gè)重要成員，在腦、心、肝、肺、皮膚及結(jié)締組織等許多器官和組織中不同程度表達(dá)，在生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[12]。

杜秋香等[7]報(bào)道，MMP-2和MMP-9在正常腦組織中表達(dá)量低，腦創(chuàng)傷后，通過(guò)絲裂原激活蛋白激酶和（或）氧化應(yīng)激途徑調(diào)控升高，在神經(jīng)元和各種膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)。在大鼠腦缺血模型中，MMP-9在缺血24h升高，一直維持到5d，而MMP-2在第5天的缺血組織中表達(dá)明顯，提示早期MMP-9表達(dá)增強(qiáng)與腦缺血損傷有相關(guān)性，而MMP-2則可能參與細(xì)胞碎片清除[13]。在皮膚的損傷愈合方面，李剛蓮等[8]利用大鼠皮膚切創(chuàng)模型觀察到MMP-2在傷后0.5～1h損傷區(qū)域的中性粒細(xì)胞內(nèi)即表達(dá)，且隨時(shí)間而增強(qiáng)，3d達(dá)到高峰，5d在成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮表達(dá)增強(qiáng)，12～14d恢復(fù)正常；MMP-9在傷后1h的中性粒細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，其余時(shí)間點(diǎn)的免疫組織化學(xué)特點(diǎn)與MMP-2相似。說(shuō)明兩者在皮膚創(chuàng)面修復(fù)的不同階段參與了基底膜溶解、血管形成、壞死組織清除和瘢痕組織重建[9]。

肝損傷后，通過(guò)兩個(gè)信號(hào)通路進(jìn)行修復(fù)，一個(gè)通路是激酶裂解血漿纖溶蛋白酶原生成血漿纖溶蛋白酶，后者溶解纖溶蛋白，激活包括MMP-9在內(nèi)的一系列MMP；另一個(gè)通路則與膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1（membrane type1-matrix metalloproteinase，MT1-MMP）和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-2（tissue inhibitors of matrix metalloproteinase-2，TIMP-2）協(xié)同激活 MMP-2[14]。肝組織中MMP-2和MMP-9主要由星狀細(xì)胞和庫(kù)普弗細(xì)胞分泌，與TIMP共同維持ECM的降解與沉積的平衡[15]。KIM等[6]利用部分肝切除大鼠模型，觀察到肝組織內(nèi)MMP-2和MMP-9分別在術(shù)后6～12h和3～6h激活，在24 h和18 h達(dá)到高峰，可持續(xù)48～72h，通過(guò)降解ECM促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，對(duì)肝損傷早期修復(fù)過(guò)程起主要作用。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)肝損傷的研究多限于化學(xué)性肝損傷的機(jī)制和肝傷后的治療。本研究借鑒MMP-2和MMP-9的生物學(xué)特性及其在腦和皮膚損傷修復(fù)過(guò)程中呈時(shí)間規(guī)律表達(dá)的特點(diǎn)，利用大鼠撞擊性肝挫傷模型觀察其蛋白表達(dá)情況。綜合免疫組織化學(xué)和Western印跡法的結(jié)果，MMP-2在損傷初期蛋白表達(dá)與對(duì)照組沒(méi)有明顯區(qū)別，僅在挫傷周邊有所表達(dá)；損傷6 h以后（除18 h組）各鄰組之間表達(dá)存在一定差異（P＜0.05）；傷后6～12h開(kāi)始表達(dá)增強(qiáng)，逐漸蔓延至整個(gè)損傷區(qū)域，中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞內(nèi)開(kāi)始表達(dá)，在24 h達(dá)到高峰，挫傷區(qū)及周邊區(qū)肝細(xì)胞內(nèi)彌漫性表達(dá)，3d時(shí)挫傷區(qū)的成纖維細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)開(kāi)始表達(dá)；5～7 d是肝損傷修復(fù)的中后期，膠原纖維增生，此時(shí)期內(nèi)MMP-2在新生區(qū)域內(nèi)的肝細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮表達(dá)。MMP-2的表達(dá)特點(diǎn)說(shuō)明其參與了肝損傷修復(fù)各階段的炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)以及新生組織的改建與塑形等過(guò)程。MMP-9蛋白表達(dá)在各鄰組之間有較為明顯的差異（P＜0.05）。在傷后 1h 即表達(dá)增高，3～12h 隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)，在18h達(dá)到高峰，24h略有下降，各時(shí)段挫傷區(qū)內(nèi)除肝細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞內(nèi)明顯表達(dá)外，大量MMP-9陽(yáng)性顆粒在細(xì)胞間隙內(nèi)彌散分布；在傷后3d，MMP-9表達(dá)雖減弱，但在壞死區(qū)內(nèi)的炎癥細(xì)胞還是高表達(dá)；傷后5～7d表達(dá)降低，但仍高于對(duì)照組，位置主要在新生的膽管上皮。上述特點(diǎn)說(shuō)明MMP-9發(fā)揮作用要早于MMP-2，并且范圍更廣，持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，對(duì)損傷早期的炎癥反應(yīng)、壞死組織的清除以及對(duì)組織再生和膽管重建起到重要作用。MMP-2和MMP-9表達(dá)增強(qiáng)的時(shí)間有所不同，可能是因?yàn)镸MP-2的前體激活因子MT1-MMP和TIMP-2以及MMP-9前體激活因子血漿纖溶酶分別是在損傷后6～18h和損傷后30min開(kāi)始增高有關(guān)，而在18～24h后出現(xiàn)下降可能是因?yàn)門(mén)IMP-1在24～48 h表達(dá)增強(qiáng)并抑制了MMP的生物學(xué)作用[15]。本研究中MMP-2和MMP-9蛋白在挫傷的肝組織中表達(dá)呈現(xiàn)良好的時(shí)序性特點(diǎn)，這與KIM等[6]的肝切除大鼠模型中兩者表達(dá)規(guī)律接近，但與腦和皮膚損傷中的表達(dá)規(guī)律[7-9]相差較大，這可能與組織的特異性以及MMP-2和MMP-9在各個(gè)官器和組織中發(fā)揮的作用不同所致。

在法醫(yī)學(xué)鑒定實(shí)踐中，有時(shí)會(huì)遇到如腹部曾遭受撞擊或暴力打擊，數(shù)小時(shí)或數(shù)天后出現(xiàn)遲發(fā)性肝破裂死亡的案例，也有短期內(nèi)腹部受到兩次甚至兩次以上外力作用而出現(xiàn)肝破裂死亡的案例，法醫(yī)學(xué)工作者需要判斷外力與肝損傷之間的關(guān)系、明確肝損傷的經(jīng)歷時(shí)間，有利于案件的偵破和對(duì)嫌疑人責(zé)任的認(rèn)定，因此，有必要對(duì)此問(wèn)題進(jìn)行深入的研究與探討。本研究采用鈍性外力直接撞擊造成肝挫傷的模型更貼近人在遭受鈍性外力所導(dǎo)致的肝損傷機(jī)制，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色和Western印跡法對(duì)大鼠肝挫傷組織進(jìn)行研究，證實(shí)了損傷組織內(nèi)MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)呈一定的時(shí)間規(guī)律性，有望為肝挫傷的時(shí)間推斷提供重要的參考指標(biāo)。

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