劉彩麗

(普研(上海)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)股份有限公司,上海 201600)

維生素是飼料中的重要組成部分，《飼料添加品種目錄》列出的維生素有32種，分為2類(lèi)：一類(lèi)是脂溶性維生素，包括VA、VD3、VE和VK3，另一類(lèi)是水溶性維生素，包括B族維生素和VC。維生素A是視紫紅質(zhì)(感光色素)的重要組成成分，維持正常視覺(jué)功能；可保護(hù)上皮組織，防止上皮細(xì)胞萎縮、角化，保護(hù)呼吸道、消化道、生殖泌尿器官黏膜，利于公畜精子生成；增強(qiáng)動(dòng)物免疫力，促進(jìn)骨骼發(fā)育[1]。但準(zhǔn)確測(cè)定飼料中VA的難度較大，主要原因是VA以微膠囊形式加入預(yù)混劑中，然后與飼料進(jìn)行干混，均勻度難以保證。VA微膠囊的粒徑比其他維生素微膠囊的粒徑大，壁材為明膠，而飼料的載體為米糠、石粉，VA顆粒在飼料中流動(dòng)很好。VA的提取方法有皂化、超聲、酶解超聲等多種方法。

雖然維生素A是一種必須攝入的脂溶性維生素，是維持機(jī)體正常代謝的重要營(yíng)養(yǎng)素，但維生素A攝入過(guò)多同樣會(huì)引起胚胎吸收、流產(chǎn)、出生缺陷等[2]。只有準(zhǔn)確掌握其正常需求量，才能真正發(fā)揮它的營(yíng)養(yǎng)作用，因此準(zhǔn)確測(cè)定飼料中VA的含量至關(guān)重要。

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)研究飼料中維生素A測(cè)定的最佳前處理?xiàng)l件，為準(zhǔn)確測(cè)定VA提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

Maxatase 酶制劑/ SAVINASE 6.0 TK / 2709堿性蛋白酶，異丙醇(色譜純)，焦性沒(méi)食子酸，L-抗壞血酸乙醇溶液, 氫氧化鉀，無(wú)水乙醚，無(wú)水乙醇，甲醇(色譜純)，正已烷(色譜純)，環(huán)已烷(色譜純)、伊利奶牛育成期精補(bǔ)料(標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定值由飼料供應(yīng)方提供)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

DS-8510DTH生析超聲儀：上海生析超聲儀器有限公司；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：東京理化器械株式會(huì)社；ANPEL氮吹儀：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；密理博純水儀：密理博中國(guó)有限公司；梅特勒分析天平：梅特勒—托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司；Agilent 1260高壓液相色譜儀(DAD 檢測(cè)器)：安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

因?yàn)閂A在飼料中的均勻度、流動(dòng)性和不同測(cè)定方法都會(huì)影響測(cè)定結(jié)果，對(duì)前處理的3個(gè)主要因素：稱(chēng)樣量，制樣方式，提取方法進(jìn)行了分析，設(shè)計(jì)了3因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，L9(33)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

1.3.2 提取方法[3]

1.3.2.1 皂化提取 按GB/T 17817—2010第一法進(jìn)行操作。

1.3.2.2 酶解超聲提取 按GB/T 7292—1999進(jìn)行操作。

1.3.2.3 酶解皂化提取 對(duì)上述2個(gè)方法進(jìn)行組合操作。

1.3.3 定量測(cè)定方法

儀器條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18，250 mm×4.6 mm，5μm；流動(dòng)相∶V(甲醇)∶V(水)=98∶2；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；波長(zhǎng)：325 nm。

分別注入20 μL的工作溶液及樣品提取溶液于液相色譜儀中，按上述色譜條件進(jìn)行色譜分析，記錄峰面積。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。

依據(jù)試樣溶液測(cè)定的響應(yīng)峰面積或峰高，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出(或用回歸方程計(jì)算出)試樣溶液的濃度C。

樣品中維生素A的含量：X=C×V/m

式中：X為樣品含量， mg/kg；V為定容體積，mL；m為稱(chēng)樣量，g 。

維生素A的分子量為286.45，維生素A乙酸酯的分子量為328.49，維生素A乙酸酯與維生素A的換算系數(shù)為1.15。

維生素A的色譜圖如圖1。

圖1 維生素A的色譜圖

1.3.4 評(píng)分方法

根據(jù)GB/T 17817—2010飼料中維生素A的測(cè)定的重復(fù)性要求和GB/T18823—2010 飼料檢測(cè)結(jié)果判斷的允許誤差，以2次平行測(cè)定所得結(jié)果的相對(duì)偏差(RPD)及測(cè)定值與標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定值(飼料供應(yīng)商的添加量)的相對(duì)誤差(δ)進(jìn)行打分，評(píng)分原則見(jiàn)表2。

表2 評(píng)分原則

注：對(duì)于評(píng)分可以根據(jù)實(shí)際情況取非整數(shù)的數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

按照L9(33)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表，每組數(shù)據(jù)進(jìn)行了2次平行測(cè)定實(shí)驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果及各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的評(píng)分見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果及各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的評(píng)分

根據(jù)各組實(shí)驗(yàn)的評(píng)分結(jié)果，進(jìn)行了方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各組數(shù)據(jù)的方差分析

從表4的極差R值可以看出各因素對(duì)測(cè)定結(jié)果影響的主次順序是： A>B>C ，即樣品狀態(tài)對(duì)測(cè)定結(jié)果影響最大，其次為稱(chēng)樣量，最后為提取方法。最佳前處理方案為A3B3C1即：原樣、稱(chēng)10 g、皂化。

3 小結(jié)

在飼料中維生素A測(cè)定過(guò)程，樣品狀態(tài)對(duì)測(cè)定結(jié)果影響最大，其次為稱(chēng)樣量。最佳的前處理方案為樣品不進(jìn)行振蕩、不進(jìn)行打樣、使用原樣進(jìn)行測(cè)定，稱(chēng)樣量為10 g，用皂化方法進(jìn)行提取。

皂化提取方法對(duì)數(shù)據(jù)的影響較小，選擇酶解超聲提取方法可提高提取效果。

建議飼料樣品的送檢時(shí)，要確保樣品用容器裝滿(mǎn)并壓實(shí)，以防止運(yùn)輸過(guò)程中樣品在容器中來(lái)回振蕩引起VA微膠囊顆粒流動(dòng)。

[1]談暠媛，魯小翠. 飼料中維生素 A 的測(cè)定方法解析[J].湖北畜牧獸醫(yī).2014，35(12)：62-63.

[2]方桂紅，程莉.維生素A的生理功能及毒性研究進(jìn)展[J]. 輕工科技. 2012(8)：10-11.

[3]鄧國(guó)東，王亞噸，毛乾慧. 飼料中維生素 A 分析方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)飼料.2016(12)：32-34.●

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