楊素清，安月鵬

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150040）

銀屑病是臨床上的常見(jiàn)病、疑難病，是一種由多基因遺傳背景決定、T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性皮膚病。對(duì)于銀屑病以往的發(fā)病機(jī)制研究主要局限于CD4+T細(xì)胞中的2大亞群Th1/Th2的細(xì)胞失衡理論。但隨著近年來(lái)研究的不斷深入，越來(lái)越多的證據(jù)表明[1]，銀屑病的發(fā)生、發(fā)展與新型的CD4+T細(xì)胞亞群Th17細(xì)胞有著密切的關(guān)系，Th17細(xì)胞與其轉(zhuǎn)導(dǎo)通路IL-23/IL-17對(duì)傳統(tǒng)Th1/Th2細(xì)胞失衡理論起到了良好的補(bǔ)充作用，進(jìn)一步的完善了銀屑病的機(jī)制學(xué)研究。本研究以中藥復(fù)方制劑蜈蚣敗毒飲為觀察藥物，對(duì)其作用于銀屑病轉(zhuǎn)基因模型小鼠外周血中Th17細(xì)胞的表達(dá)情況進(jìn)行隨機(jī)對(duì)照研究，從新的角度揭示蜈蚣敗毒飲的作用機(jī)制，為從中醫(yī)“毒”、“瘀”理論辨治銀屑病提供研究依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器 流式細(xì)胞儀FACSCanto（美國(guó)BD公司）、CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)Binder公司），手動(dòng)移液器（美國(guó)Labnet Biopette公司）、電動(dòng)移液器（美國(guó)Drummond公司）、生物安全柜（美國(guó)Labconco公司）。

1.1.2 試劑 無(wú)菌蒸餾水，戊巴比妥鈉，肝素鈉，固定破膜緩沖液，4%多聚甲醛，2%FBS PBS，Leukocyte ActivationCocktail，withBDGolgiPlugTM（BD200 μL），F(xiàn)ixation/Permeabilization Solution Kit（BD 250Test），CD4-FITC（BD 100 μg），IL-17A-PE（BD 100 μg）。

1.1.3 動(dòng)物 轉(zhuǎn)基因表達(dá)K5.Stat3C的銀屑病模型小鼠[2]，共 25 只，體質(zhì)量 180～220 g，均為雄性，轉(zhuǎn)基因小鼠由南京大學(xué)—南京生物醫(yī)藥研究院制備。

1.2 方法

1.2.1 藥液制備 中藥制劑蜈蚣敗毒飲由蜈蚣3 g、烏梢蛇 20 g、鬼箭羽 30 g、土茯苓 30 g、紫草 30 g、甘草10 g組成，草藥來(lái)自于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院草藥局，上述草藥經(jīng)常規(guī)煎煮2次，第1次煎煮前先加入8倍的水量浸泡4 h，再進(jìn)行煎煮1 h；第2次煎煮時(shí)加入6倍的水量后直接進(jìn)行煎煮，時(shí)間為1 h。最后將2次煎煮的藥液進(jìn)行混合均勻，分別濃縮成1.48、2.97、5.94 g/mL的蜈蚣敗毒飲低、中、高劑量組，分別相當(dāng)于成人常規(guī)用量的5倍、10倍、20倍。西藥甲氨蝶呤片（國(guó)藥準(zhǔn)字H31020644，上海信誼藥廠有限公司，規(guī)格2.5 mg/片），以15 mg的甲氨蝶呤溶于134.41 mL蒸餾水中，配制成濃度為0.11 g/L的甲氨蝶呤混懸液，相當(dāng)于成人常規(guī)用量的10倍。

1.2.2 含藥PBMC制備 采用隨機(jī)的方法將K5.Stat3C轉(zhuǎn)基因銀屑病模型小鼠分為5組，每組5只，分別為蜈蚣敗毒飲低劑量組、蜈蚣敗毒飲中劑量組、蜈蚣敗毒飲高劑量組、甲氨蝶呤西藥對(duì)照組、生理鹽水空白對(duì)照組。5組轉(zhuǎn)基因小鼠的灌胃劑量均為2 mL/100（g·d），每日分早晚2次進(jìn)行。蜈蚣敗毒飲各劑量組、生理鹽水空白對(duì)照組連續(xù)灌胃8 d；甲氨蝶呤西藥對(duì)照組前4 d連續(xù)灌胃，后4 d以生理鹽水進(jìn)行灌胃，灌胃劑量及頻次同前，如此符合甲氨蝶呤臨床患者的藥物服用方法。末次給藥后1 h，各組轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉（35 mg/kg）腹腔注射麻醉，將小鼠固定在手術(shù)臺(tái)上，在無(wú)菌的條件下經(jīng)腹主動(dòng)脈取血4 mL。抽取的血液于肝素鈉真空采血管中，混勻，常溫保存，并于2 h內(nèi)提取PBMC供流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)。

1.2.3 Ficoll密度梯度離心法分離PBMC 肝素鈉抗凝全血1.5～2mL（同組小鼠血樣合并）于1500轉(zhuǎn)/min的室溫離心6 min，血漿吸出分裝于2 mL凍存管中，-80℃保存進(jìn)行細(xì)胞因子檢測(cè)。血細(xì)胞加入2倍體積的PBS后混勻。加入3 mL淋巴細(xì)胞分離液置離心管中，將稀釋后的抗凝血貼壁加入離心管；淋巴細(xì)胞分離液與稀釋后的血細(xì)胞體積比為1∶1。然后經(jīng)2 000轉(zhuǎn)/min室溫不剎車(chē)離心20 min，吸取白膜層，為所需的PBMC細(xì)胞。白膜層用等量的PBS洗滌2次，以1 500轉(zhuǎn)/（min·4℃）離心8 min，棄去上清。用1 mL RPMI1640重懸細(xì)胞沉淀，取10 μL用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 PBMC刺激培養(yǎng) 用10%FBS RPMI-1640稀釋至PBMC終濃度0.5～1×106細(xì)胞/mL；于24孔板中加入1 mL細(xì)胞懸液，并加入2 μL PMA及離子霉素刺激劑（含Golgiplug），37℃孵育5 h。

1.2.5 細(xì)胞染色 各組細(xì)胞1 000轉(zhuǎn)/min離心10 min，棄上清。加入500 μL 2%FBS PBS洗滌1次，1 000轉(zhuǎn)/min離心10 min，棄上清。表面標(biāo)記染色：加入10 μL 2%FBS PBS重懸細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞分成2份，分別加入CD4-FITC抗體及IgG-FITC同型對(duì)照，4℃避光孵育30 min后，用500 μL 2%FBS PBS洗滌2次，棄上清。

1.2.6 破膜固定 加入250 μL固定破膜緩沖液，4℃孵育20 min，加入1 mL固定破膜洗滌液，洗滌2次。破膜固定后加入100 μL 4%多聚甲醛，4℃固定15 min，加入 500 μL 2%FBS PBS洗滌 2次后，加入500 μL 2%FBS PBS重懸細(xì)胞沉淀，4℃保存，72 h內(nèi)進(jìn)行胞內(nèi)染色及檢測(cè)。

1.2.7 胞內(nèi)染色 加入50 μL固定破膜洗滌液重懸細(xì)胞沉淀，分別加入IL-17-PE抗體IgG-PE同型對(duì)照，4℃避光孵育30 min后，用1 mL固定破膜洗滌液洗滌2次，棄上清。加入500 μL 2%FBS PBS或4%多聚甲醛重懸細(xì)胞沉淀，流式上機(jī)檢測(cè)。

1.2.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 將對(duì)照組流式樣本先上機(jī)，調(diào)節(jié)電壓及FITC和PE管設(shè)置補(bǔ)償條件。將各實(shí)驗(yàn)組樣本按上述條件于流式細(xì)胞儀上對(duì)PE+FITC管進(jìn)行檢測(cè)，其中每管共計(jì)數(shù)為20 000個(gè)細(xì)胞，從而測(cè)定 PE（+）、FITC（+）細(xì)胞的分布、PE 平均的熒光強(qiáng)度。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)的處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，其中計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的形式來(lái)表示，2組間的計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。組間比較檢驗(yàn)前先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性分析，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布或方差齊性，則采用上述檢驗(yàn)方法進(jìn)行，反之則采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。檢驗(yàn)中α取雙尾0.05，以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

蜈蚣敗毒飲對(duì)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)小鼠外周血PBMC中Th17細(xì)胞表達(dá)率情況見(jiàn)表1及圖1～5（對(duì)應(yīng)流式細(xì)胞圖中的Q4）。

表1 蜈蚣敗毒飲對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠外周血PBMC中Th17細(xì)胞表達(dá)率的影響

圖1 空白對(duì)照組外周血Th17細(xì)胞表達(dá)

圖2 甲氨蝶呤西藥對(duì)照組外周血Th17細(xì)胞表達(dá)

圖3 蜈蚣敗毒飲低劑量組外周血Th17細(xì)胞表達(dá)

圖4 蜈蚣敗毒飲中劑量組外周血Th17細(xì)胞表達(dá)

圖5 蜈蚣敗毒飲高劑量組外周血Th17細(xì)胞表達(dá)

3 討論

免疫學(xué)異常是銀屑病發(fā)病機(jī)制的中心環(huán)節(jié)，銀屑病的發(fā)生是由多細(xì)胞、多因子所介導(dǎo)的免疫異常性皮膚疾病，既往的研究主要集中于人體內(nèi)Th細(xì)胞的Th0、Th1和Th2亞群，Th1/Th2漂移理論在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中占據(jù)主導(dǎo)地位，尤其是IL-2、IFN-γ、TNF-α等為代表的Th1細(xì)胞因子在銀屑病的發(fā)病中最為重要，這些都說(shuō)明了銀屑病是發(fā)生了Th1/Th2漂移且以Th1反應(yīng)模式為主，即偏向Th1漂移的免疫性疾病。Th17新型T細(xì)胞亞群的出現(xiàn)彌補(bǔ)了Th1/Th2效應(yīng)機(jī)制的不足，同時(shí)將銀屑病等諸多疾病的研究帶入了新的世界[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，初始的T細(xì)胞可以在IL-6和TGF-β的協(xié)同誘導(dǎo)下，激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子，從而促進(jìn)初始的CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞的分化，同時(shí)TGF-β亦可誘導(dǎo)T細(xì)胞IL-23受體的表達(dá)，使得Th17細(xì)胞對(duì)IL-23產(chǎn)生反應(yīng)，而后使Th17細(xì)胞高表達(dá)IL-17，發(fā)生IL-23-Th-17-IL-17轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而在銀屑病患者皮損處可發(fā)現(xiàn)IL-17的表達(dá)[4]。越來(lái)越多的研究結(jié)果表明，Th17的這種細(xì)胞通路參與了銀屑病疾病的發(fā)生和發(fā)展當(dāng)中[5]。

蜈蚣敗毒飲的理論依據(jù)于中醫(yī)學(xué)的“毒”、“瘀”辨治體系[6-7]，在組方中融合了中醫(yī)學(xué)祛風(fēng)毒、清熱毒、除濕毒、化瘀毒等的解毒化瘀之品，圍繞疾病“病由毒生”和“久病必瘀”兩大理論，針對(duì)疾病的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸，創(chuàng)新性的提出了銀屑病的“毒蘊(yùn)瘀結(jié)”發(fā)病機(jī)制，在治療上貫以“解毒消源，祛瘀截末，輔以防變”的辨治思想。既往研究主要圍繞Th1/Th2漂移理論先后對(duì) IL-2、IL-8、TNF-α、ET-1 等細(xì)胞因子進(jìn)行了研究[8]，以及對(duì)HaCaT、HUVEC細(xì)胞的增殖和凋亡及其相關(guān)基因表達(dá)等方面進(jìn)行了探索[9]，較為系統(tǒng)的對(duì)蜈蚣敗毒飲的作用機(jī)制進(jìn)行了分析，本研究再次針對(duì)于Th17細(xì)胞體系進(jìn)行了初步血清學(xué)檢測(cè)，對(duì)于Th1/Th2/Th17三大T細(xì)胞亞群的整體作用機(jī)制進(jìn)行了良好的鋪墊，為不斷發(fā)現(xiàn)蜈蚣敗毒飲等中醫(yī)中藥治療機(jī)制方面的多靶點(diǎn)優(yōu)勢(shì)奠定了基礎(chǔ)。

本研究采用了流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了銀屑病轉(zhuǎn)基因模型小鼠外周血PBMC的Th17細(xì)胞的表達(dá)情況。研究結(jié)果顯示，甲氨蝶呤及蜈蚣敗毒飲各劑量組均有降低外周血PBMC的Th17細(xì)胞表達(dá)的作用，其中尤以甲氨蝶呤西藥對(duì)照組和蜈蚣敗毒飲高劑量組的作用最為顯著（P＜0.01），蜈蚣敗毒飲各劑量組隨著濃度的增高呈現(xiàn)出一定的量效依賴(lài)關(guān)系。研究結(jié)果初步揭示了蜈蚣敗毒飲可以針對(duì)外周血PBMC中Th17細(xì)胞，影響Th17細(xì)胞的表達(dá)，從而推測(cè)對(duì)于銀屑病的皮損具有相應(yīng)的作用效應(yīng)。本研究為后期研究提供了相應(yīng)的保障，為今后蜈蚣敗毒飲針對(duì)于Th17細(xì)胞體系中的某個(gè)具體環(huán)節(jié)或特異性因子的檢測(cè)和分析提供了理論支持，同時(shí)，針對(duì)于Th17細(xì)胞機(jī)制和銀屑病模型皮損嚴(yán)重程度的相關(guān)性研究亦是今后課題探索的思路和新的方向。

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