羅勝勇 栗原博 樂志勇 于留榮 曹暉

摘要：測定了天然冬蟲夏草、人工培育冬蟲夏草及發(fā)酵蟲草菌粉三種蟲草樣品水提取物的體外抗氧化能力及其所含SOD活性，分析了3種樣品體外抗氧化能力大小是否與其所含SOD活性高低有關。測定結果表明：各樣品對DPPH·、超氧陰離子都有很好的清除作用，最大清除率大小依次為：天然冬蟲夏草、人工培育冬蟲夏草、發(fā)酵蟲草菌粉;半教清除濃度從小到大依次為：天然冬蟲夏草、人工培育冬蟲夏草、發(fā)酵蟲草茵粉。各樣品均具有一定的總抗氧化力和總還原力，總抗氧化能力大小依次為：天然冬蟲夏草、人工培育冬蟲夏草、發(fā)酵蟲草茵粉;總還原力大小依次為：天然冬蟲夏草、發(fā)酵蟲草菌粉、人工培育冬蟲夏草。樣品SOD活性高低依次為：天然冬蟲夏草、人工培育冬蟲夏草、發(fā)酵蟲草菌粉。3種樣品體外抗氧化能力高低與其所含SOD活性高低有密切關系。

關鍵詞：天然冬蟲夏草;人工培育冬蟲夏草;發(fā)酵蟲草菌粉;抗氧化活性;超氧化物歧化酶

中圖分類號：R282. 71

文獻標識碼：A

文章編號：1674-9944（2018）14-0245-04

1 引言

氧自由基是一類具有不配對電子的活潑化學基團，與人體健康具有密切關系。生理狀況下，人體內氧自由基的產(chǎn)生和清除保持平衡，但當體內清除自由基物質不足、自由基過多時，就會與許多生物大分子發(fā)生氧化損傷反應?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明衰老、炎癥、癌癥、心血管疾病以及帕金森阿爾茨海默氏等神經(jīng)退行性疾病都與自由基氧化損傷有關。因此，尋找高效、無毒的具有清除自由基作用的天然抗氧化活性的物質，對預防疾病、延緩衰老具有重要的意義。冬蟲夏草（Cordyceps sinensis （Berk.） Sacc.）為麥角菌科真菌寄生在蟲草蝙蝠蛾（Hepialus armoricanus）幼蟲上的子座及幼蟲內菌核的復合體，是一種名貴的滋補性傳統(tǒng)中藥材，除含有蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖外，還含有豐富的超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD），具有明顯的抗氧化功能。但由丁天然野蟲草資源有限，現(xiàn)市場上多采用人工培養(yǎng)蟲草和發(fā)酵蟲草產(chǎn)物進行替代。研究擬對3種蟲草水提取物抗氧化能力及其所含SOD酶活性進行測定和比較，為今后更加科學合理的利用3種蟲草資源、開發(fā)抗氧化的蟲草保健品提供理論依據(jù)。

2材料與方法

2.1材料和試劑

天然冬蟲夏草、人工培育冬蟲夏草，由康美（北京）藥物研究院有限公司

提供.批號：201607;發(fā)酵蟲草菌粉，由浙江萬豐企業(yè)集團制藥有限公司提供，批號：201404225。1，1-二苯基-2-：j硝基苯臍（DPPH），MACKLIN公司提供，批號：C10085683;鄰二氮菲，MACKLIN公司提供，批號：C10073869;NADH，Solarbio公司提供，批號：No.81180313;NBT，BIOSHARP公司提供;三氯醋酸，天津市致遠化學試劑有限公司提供，批號：20160920;吩嗪硫酸甲酯（PMS），aladdin公司提供，批號：A1614069;2，4，6-三吡啶三吖嗪（TPTZ），Solarbio公司提供，批號：No. 5258021;硫酸亞鐵（FeSO₄），國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)，批號：2016。229;三氯化鐵，上海蘇懿化學試劑有限公司提供，批號：20160616;雙氧水（H₂O₂），國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)，批號：20161008;Ve（分析純），上海潤捷化學試劑有限公司，批號：20160701;SOD試劑盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號：20160516。

2.2儀器與設備

AL104電子天平，梅特勒一托利多（上海）有限公司提供：LTV-1750紫外可見分光光度計，日本島津公司生產(chǎn);電熱水浴鍋，上海醫(yī)療器械五廠生產(chǎn)：GL -16G- Ⅱ型高速離心機，上海安亭科學儀器廠生產(chǎn)。

2.3樣品制備

水提?。焊鳂悠啡?g細粉，用25 mL水在25℃振蕩提取，隔日用3000 r/min離心15 min，收集上清液，殘渣再用少量水浸提1次，合并2次提取液，定容至40mL，樣品濃度計為50 mg/mL。取1/2樣品用于體外抗氧化實驗，剩余樣品用于測定SOD酶活性。

2.4樣品中SOD測定

丙酮純化：樣品經(jīng)水提取，將離心后上清液倒人燒杯并置冰水浴中沿杯壁加入1倍體積預冷至-15℃的丙酮，再以3000r/min離心15 min，棄去沉淀。上清液加入0.8倍體積預冷至-15℃的丙酮，靜置后離心收集沉淀，將沉淀溶于少量蒸餾水中，透析出除去丙酮。即可得到所需的酶溶液。取各樣品丙酮純化液，按照試劑盒說明分別進行SOD酶活力的測定和計算。

2.5 清除DPPH·（1，1-二苯基-2-三硝基苯臍試驗

樣品水提取液原液濃度均為50 mg/mL，分別用雙蒸水倍比稀釋成25 mg/mL，12.5 mg/mL，6.25 mg/mL，3.12 mg/mL，1. 56 mg/mL，0. 78 mg/mL。4℃保存待用。精確吸取1.0 mL不同濃度各樣品液予10 mL試管中，再加入4.0 mL 0.004% （w/v）的DPPH自由慕溶液（用無水乙醇配制），使總體積為5.0 mL。用力搖勻后窒溫放置30 min后于524 nm處測吸光度值（紫外分光光度計）。每個樣品重復測定3次，取平均值。樣品液對DPPH的清除率R按公式計算：

R=[A₀-（A₁-A₂）]/A₀×100%

（1）

式（1）中，A₀=4 mLDPPH，溶液+1 mL無水乙醇溶液的吸光度值;A₁=4 mLDPPH，溶液+1 mL樣品液的吸光度值;A₂=4 mL，無水乙醇溶液+1 mL樣品液的吸光度值。

以清除率R對樣品濃度進行回歸處理，計算出各樣品的半數(shù)抑制濃度（IC50）數(shù)值。

2.6清除超氧陰離子自由基作用

精確吸取0. 1mL不同濃度的樣品溶液，依次加入1.0 mL磷酸鹽緩沖液（pH值7.4）、1.0 mL 150 μmol/L的NBT（pH值7.4的磷酸鹽緩沖液配制）、1.0 mL468 μmol，/L的NADH（用pH值7.4的磷酸鹽緩沖液配制）、0.1 mL 60μmol/L的PMS（用pH值7.4的磷酸鹽緩沖液配制），混勻，室溫下（25℃）靜置反應5mm，在560 nm下測定吸光度A。每個樣品重復測定3次，取平均值。樣品液對超氧陰離子的清除率R按公式計算：

R=（ AO - A1）/AO×100%

（2）

式（2）中，A0=0.1mL，甲醇溶液+1.0mL磷酸鹽緩沖液+1.0mLNBT+1.0mLNADH +0.1 mL PMS的吸光度值;A1=0.1 mL，樣品溶液+1.0 mL磷酸鹽緩沖液+1. 0mLNBT+1. 0mLNADH+0.1 mLPMS的吸光度值。

以清除率R對樣品濃度進行回歸處理，計算出各樣品的半數(shù)抑制濃度（IC50）數(shù)值。

2.7 總抗氧化力測定（FRAP）

TPTZ工作液由25 mL醋酸鹽緩沖液（300 mmol/L，pH=3.6） ，2.5 mL 10 mmol/L TPTZ（用40 mmol/LHCl配制），2.5 mL FeCl₃ （FeCl₃·6H₂0，20 mmol/L）溶液配制而成。分別取不同體積（0. 15、0.20、0.25、0. 30、0.35、0.40、0.45、0.50 mL）的0.25 mmol/LFeSO₄溶液，用蒸餾水補充至2 mL，再加入1 mL TPTZ工作液，混勻后于37℃反應20 min，后丁593 nm處測定吸光度。用X軸表示FeSO₄溶液的摩爾質量，Y軸表示吸光度，得標準曲線。取不同濃度提取物溶液2mL，再加入1 mL TPTZ工作液，混勻后于37℃反應20 min，后于593 nm處測定吸光度。每個樣品重復測定3次，取平均值。根據(jù)吸光度值和標準曲線，計算結果表示為1g提取物中FeSO₄（ mmol/L）含有量。

2.8總還原力測定

取1 mL不同濃度樣液于試管中，依次加入2.5 mL0.2 mol/L pH=6.6磷酸緩沖溶液和2.5mL 1%鐵氰化鉀（ K₃ Fe（ CN）₆）溶液，50℃水浴保溫20 min后決速冷卻，再加入2.5 mL 10%三氯醋酸溶液，4000 r/min離心10 min，取上清夜2.5 mL。向該上清液中依次加入2.5 mL蒸餾水，0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液振蕩搖勻，靜置10 min。700 nm下測其吸光度值（OD），吸光度越大，其總還原力越強。

實驗組（ Ai）：1 mL樣品+2.5 mL緩沖液+2.5mL鐵氰化鉀+2.5 mL三氯乙酸+2.5 mL雙蒸水+0.5 mL三氯化鐵

對照組（Ao）：1 mL雙蒸水+2.5 mL緩沖液+2.5mL鐵氰化鉀+2.5 mL三氯乙酸+2.5 mL雙蒸水+0.5 mL三氯化鐵

空白組（Aj）：1 mL樣品+2.5 mL緩沖液十雙蒸水8 mL（加入量=鐵氰化鉀十三氯乙酸十雙蒸水十三氯化鐵的總量）

清除率（%）=[1- （Ai-Aj）/Ao]×100.

2.9數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以x±S表示，組間比較采用t檢驗。

3結果

3.1各樣品中SOD含量

每個樣品取提取原液進行測定（50 mg/mL），重復3次。結果顯示，天然蟲草中SOD含量最高，人工培育蟲草次之，發(fā)酵蟲草菌粉中SOD含量最低。具體結果見表1。

3.2各樣品對DPPH·的清除作用

結果顯示，各樣品對DPPH·都有很好的清除作用，最大清除率從大到小依次為：滅然蟲草、人工培育蟲草、蟲草菌粉，3種樣品對DPPH·最大清除率差異有顯著性;DPPH·半數(shù)清除濃度從小到大依次為：天然蟲草、人工培育蟲草、蟲草菌粉，3種樣品對DPPH·半數(shù)清除濃度差異有顯著性。具體結果見表2、3。

3.3各樣品對超氧陰離子清除作用

結果顯示，各樣品對超氧陰離子都有很好的清除作用，最大清除率從大到小依次為：天然蟲草、人工培育蟲草、蟲草菌粉，3種樣品對超氧陰離子最大清除率差異有顯著性;超氧陰離子半數(shù)清除濃度從小到大依次為：天然蟲草、人工培育蟲草、蟲草菌粉，3種樣品對超氧陰離子半數(shù)清除濃度差異有顯著性。具體結果見表4、5。

3.4各樣品總抗氧化力

3.4.1硫酸亞鐵標準曲線

根據(jù)濃度梯度測定吸光度值計算標準曲線，具體結果見表6、圖1。

3.4.2 各樣品吸光度值及總抗氧化能力

根據(jù)硫酸亞鐵含量標準曲線和各樣品吸光度值，計算各樣品中硫酸亞鐵含量，并以硫酸亞鐵含量大小反應各樣品總抗氧化能力大小。結果顯示，各樣品均有一定的總抗氧化能力，總抗氧化能力最強為天然蟲草，人工培育蟲草和蟲草菌粉次之。與天然蟲草相比，人工培育蟲草和蟲草菌粉總抗氧化能力有明顯降低，差異有顯著性，人工培育蟲草與蟲草菌粉差異無顯著性。具體結果見表7。

4討論

目前市場中蟲草主要分為天然蟲草，人工培育蟲草和蟲草菌粉三類。以往研究表明冬蟲夏草中具有明顯抗氧化作用，并含有豐富的超氧化物歧化酶（ SOD），但關于天然蟲草與人工培育蟲草及蟲草菌粉的抗氧化能力之間的比較研究以及蟲草產(chǎn)品的抗氧化能力與其所含的SOD是否有關還缺少報道。由于天然產(chǎn)物中含有成分較多，采用不同的抗氧化活性評價體系，不同溶劑提取物的抗氧化活性存在差異”。因此在進行抗氧化劑篩選時，應該采用多種方法綜合評定中藥的抗氧化能力才較為準確。研究表明DPPH·自由基清除率與OH清除率、H₂O₂清除率相關性很低，但DPPH·自由基清除率與總抗氧化能力和總還原能力間呈顯著性相關性。而·OH清除率、H₂O₂清除率與總抗氧化能力和總還原能力相關性也較低。因此本研究采用DPPH·、超氧陰離子自由基清除率、總抗氧化活性、總還原能力測定實驗，以便更科學全面地評價受試樣品的體外抗氧化能力。結果顯示，3種樣品均具有明顯的體外抗氧化能力，在DPPH·清除、超氧陰離子自由基清除和總抗氧化能力測定試驗中，天然蟲草的作用均最為明顯，人工蟲草次之，蟲草菌粉作用相對最弱，在總還原力測定中試驗中，天然蟲草作用仍為最強，蟲草菌粉次之，人工蟲草作用相對最弱。總體評價，天然蟲草的體外抗氧化能力最強，人工蟲草次之，蟲草菌粉作用相對最弱。

本研究結果還表明，天然蟲草和人工蟲草中均有明顯SOD活性，而天然蟲草活性相對更高，蟲草菌粉則基本無明顯SOD活性，與之相對應的是天然蟲草的體外抗氧化能力最強，人上蟲草次之，蟲草菌粉作用最弱。上述結果表明蟲草的體外抗氧化能力大小與其所含SOD活性高低有密切關系，SOD活一降高低可以作為蟲草產(chǎn)品的體外抗氧化能力的一個重要評價指標。雖然3種蟲草抗氧化能力有差異，但在天然資源有限的情況下，人工培育蟲草和蟲草菌粉仍然不失為良好的替代品。本次試驗結果可為更加科學合理地利用蟲草資源提供新的理論依據(jù)。

同時研究中也發(fā)現(xiàn)，蟲草菌粉基本無SOD活性，但也表現(xiàn)出明顯的抗氧化作用，表明蟲草的抗氧化作用可能還與其他成分有關，比如蟲草多糖等。另外應該注意的是，冬蟲夏草作為一種滋補藥材，主要還是以口服為主，因此后續(xù)將進一步對其體內的抗氧化作用進行深入研究。