董守坤，馬玉玲，李 爽，董 娜，劉麗君

（東北農業(yè)大學農學院，哈爾濱 150030）

活性氧（ROS）是一類由O2轉化的自由基或具有高反應活性的離子或分子[1]，低濃度時，ROS作為第二信使在細胞信號轉導途徑中介導多種應答反應，高濃度時，引起細胞損傷甚至死亡[2-4]。植物生長過程中，干旱等脅迫誘導植物體相關氧化脅迫反應，產生大量活性氧（ROS）[5]，為防御ROS毒害作用，植物激活抗氧化系統(tǒng)對脅迫作應答反應，維持或重建氧化還原平衡[6-8]?？寡趸到y(tǒng)包括抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)系統(tǒng)（ASA-GSH）和抗氧化酶類（超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶）等[9-11]，其中抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)系統(tǒng)是植物體內清除ROS重要途徑?？寡趸到y(tǒng)通過調節(jié)活性氧水平，影響生物功能；通過各種酶類和非酶類抗氧化劑參與反應，調節(jié)植物生理機能[12]。目前，干旱脅迫下植物抗氧化系統(tǒng)研究多集中于抗氧化酶防御系統(tǒng)，而ASA-GSH循環(huán)研究較少。

黑龍江省作為我國農業(yè)大省，是大豆主產區(qū)，6～9月份降雨量可達全年降雨量60%～80%，區(qū)域和四季降雨量分布不均[13]。近年，春旱發(fā)生頻率增高，夏秋季干旱時有發(fā)生，夏季連續(xù)干旱逐漸增多。2016年，東北地區(qū)7月份以來，持續(xù)高溫，降雨量減少，土地失墑嚴重，影響農作物生長。因此，明確大豆在水分最敏感時期（開花期）的耐旱機制具有重要意義。

本文以種子萌發(fā)期耐旱性不同大豆品種黑農44和黑農65為試驗材料，開花期干旱脅迫處理，測定抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)系統(tǒng)相關指標，探討干旱脅迫條件下ASA-GSH循環(huán)清除ROS機制，以期為深入研究大豆響應干旱脅迫機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試大豆品種為黑農44（HN44）和黑農65（HN65）。黑農44為耐旱型品種，黑農65為敏感型品種（本課題組于2011年鑒定篩選）[14]。

1.2 試驗設計

試驗于2017年5月13日東北農業(yè)大學校內玻璃防雨棚內開展，盆栽選用塑料桶（直徑28 cm，高33 cm），底部打孔，裝土量13 kg，每盆保苗3株，EM-50水分測定儀監(jiān)測土壤水分。為保持大豆植株生長時間相同，形成不同干旱梯度，具體處理方法如下：R1期以前保持土壤適宜水分，從R1期開始，第1組連續(xù)斷水（干旱）7 d；第2組從第1組斷水1 d后開始斷水，斷水（干旱）6 d；第3組從第1組斷水2 d后開始，斷水（干旱）5 d；第4組從第1組斷水3 d后開始斷水，斷水（干旱）4 d；第5組從第1組斷水4 d后開始斷水，斷水（干旱）3 d；第6組從第1組斷水5 d后開始斷水，斷水（干旱）2 d；第7組從第1組斷水6 d后開始斷水，斷水（干旱）1 d；第8組為對照（CK），保持適宜水分，即斷水（干旱）0 d。R1期后7 d形成干旱0、1、2、3、4、5、6和7 d，共8個處理。于處理完成后8:00～9:00取大豆倒2和倒3葉片混勻（以每盆為單位），5次重復，液氮中速凍，儲存于-80℃超低溫冰箱中待測，記錄當天各干旱處理土壤含水率。

復水處理：干旱脅迫取樣完成后對各處理復水，復水期間土壤含水率控制與對照相同。于復水后第7天上午8:00～9:00取大豆倒2和倒3葉片混勻（以每盆為單位），5次重復，液氮中速凍，-80℃超低溫冰箱待測。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 丙二醛（MDA）含量的測定

采用硫代巴比妥酸法[15]，于532、600和450 nm波長測量消光度。

1.3.2 抗氧化物質含量測定

還原型抗壞血酸（ASA）：根據(jù)試劑盒說明書（購自蘇州科銘生物技術有限公司）于265 nm波長記錄30和150 s吸光值。

脫氫抗壞血酸（DHA）：根據(jù)試劑盒說明書（購自蘇州科銘生物技術有限公司）于265 nm比色，記錄10和130 s吸光值。

還原型谷胱甘肽（GSH）：根據(jù)試劑盒說明書（購自蘇州科銘生物技術有限公司）于412 nm測定吸光值。

氧化型谷胱甘肽（GSSG）：根據(jù)試劑盒說明書（購自蘇州科銘生物技術有限公司）于412 nm比色，測定30和150 s吸光值。

1.3.3 抗氧化酶活性測定

抗壞血酸過氧化物酶（APX）：采用比色法于290 nm比色，記錄吸光值，計算。

谷胱甘肽還原酶（GR）：根據(jù)試劑盒說明書（購自蘇州科銘生物技術有限公司）于340 nm迅速測定初始吸光度和180 s吸光度。

單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR)：根據(jù)試劑盒說明書（購自蘇州科銘生物技術有限公司）于340 nm比色，記錄30 s和150 s吸光值。

脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR)：根據(jù)試劑盒說明書（購自蘇州科銘生物技術有限公司）于265 nm比色，記錄30 s和150 s吸光值。

1.3.4 總抗氧化能力（T-AOC）

根據(jù)試劑盒說明書（購自蘇州科銘生物技術有限公司）于593 nm測定吸光值。

土壤含水率測定：EM-50探針插入桶內土壤中部，測土壤含水率。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對大豆葉片膜脂過氧化程度的影響

由圖1可知，隨土壤含水率降低，HN44和HN65中MDA含量呈升高趨勢。當土壤含水率為24.1%、22.3%、20.8%和20.1%時，HN44中MDA含量變化不大，但當土壤含水率降至15.5%時，HN44中MDA含量迅速上升1.65倍。HN65中MDA含量基本處于勻速上升趨勢，HN65中MDA含量始終高于HN44，除對照組外，其余處理HN44和HN65中MDA含量差異均呈顯著水平。當土壤含水率降低至14.5%，即干旱持續(xù)7 d時，HN65中MDA含量相比HN44高13.52%。

圖1 不同土壤含水率對MDA含量的影響Fig.1 Effect on MDA content under different soil water content

2.2 干旱脅迫對大豆葉片ASA-GSH循環(huán)的影響

2.2.1 ASA-GSH循環(huán)中抗氧化物質含量

由圖2A可知，隨土壤含水率降低，HN44和HN65中ASA含量呈先升后降趨勢。當土壤含水率為24.1%、22.3%、20.8%和20.1%時，HN44和HN65中ASA含量變化不大，但當土壤含水率下降至15.5%時，HN44和HN65中ASA含量迅速上升12.11倍，6.19倍，兩品種間ASA含量差異顯著，當干旱持續(xù)至第6～7天時，HN44中ASA含量略高于HN65，差異不顯著。HN44中ASA含量在土壤含水率為15.5%時到達峰值，HN65在土壤含水率為14.7%時到達峰值。

由圖2B可知，隨土壤含水率降低，HN44和HN65中DHA含量變化趨勢呈升高趨勢。當土壤含水率為24.1%、22.3%、20.8%和20.1%時，HN44和HN65中DHA含量變化不大，但當土壤含水率下降至15.5%時，HN44和HN65中DHA含量迅速上升12.77倍、7.58倍。當干旱持續(xù)至第6和7天時，HN44中DHA含量略高于HN65，差異不顯著，與第5天相比，含量變化不明顯。

ASA/DHA可反映細胞氧化還原狀態(tài)，由圖2C可知，ASA/DHA隨土壤含水率降低，兩品種ASA/DHA呈先升后降趨勢，第4天達峰值，隨后下降，兩品種間差異顯著。

圖2 不同土壤含水率對ASA、DHA含量及ASA/DHA影響Fig.2 Effect on ASA,DHA contents and ASA/DHA ratio under different soil water content

由圖3A可知，隨土壤含水率降低，HN44和HN65中GSH含量呈先升后降趨勢。當土壤含水率為24.1%和22.3%時，HN44和HN65中GSH含量變化不大，當土壤含水率為20.8%和20.1%時，HN44和HN65中GSH含量上升明顯，當土壤含水率降低至15.5%，即干旱持續(xù)5 d時，GSH含量迅速上升，上升幅度為干旱持續(xù)4 d的6.47倍、2.27倍。當干旱持續(xù)至第6～7天時，兩品種GSH含量降低，差異顯著。

由圖3B可知，隨土壤含水率降低，HN44和HN65中GSSG含量呈升高趨勢。當土壤含水率為24.1%和22.3%時，HN44和HN65中GSSG含量變化較小，當土壤含水率為20.8%和20.1%時，HN44和HN65中GSSG含量顯著上升，HN44上升幅度大于HN65。當土壤含水率降低至14.5%時，兩品種GSSG含量達到最大值。除干旱脅迫第5天，其余處理天數(shù)內，HN44和HN65中GSSG含量差異顯著。

由圖3C可知，隨土壤含水率降低，HN44和HN65中GSH/GSSG基本呈降-升-降趨勢，且兩品種GSH/GSSG差異顯著。

圖3 不同土壤含水率對GSH、GSSG含量及GSH/GSSG的影響Fig.3 Effect on GSH,GSSG contents and GSH/GSSG ratio under different soil water content

2.2.2 ASA-GSH循環(huán)中抗氧化酶活性

由圖4A可知，隨土壤含水率降低，HN44和HN65的APX活性呈先升后降趨勢。當土壤含水率為24.1%、22.3%、20.8%和20.1%時，HN44的APX活性變化不大，HN65在干旱6 d時，APX活性略升高。HN44的APX活性在土壤含水率降低至14.7%，即干旱持續(xù)6 d時達到峰值，HN65的APX在土壤含水率降低至15.5%，即干旱持續(xù)5 d時，達到峰值，HN44的APX峰值活性較HN65高40.62%。在處理時間內，HN44的APX活性均高于HN65，且差異顯著。由圖4B可知，隨土壤含水率降低，HN44的GR活性呈先升后降趨勢，HN65的GR活性呈升高趨勢。在土壤含水率降低至15.5%，即干旱持續(xù)5 d時，HN44的GR活性達到峰值。除干旱脅迫第4天，其余處理天數(shù)內，HN44和HN65 GR活性差異顯著。

由圖5A可知，隨土壤含水率降低，HN44的MDHAR活性呈先升后降趨勢，HN65的MDHAR呈緩慢上升趨勢。當土壤含水率為24.1%、22.3%、20.8%和20.1%時，HN44的MDHAR活性變化不大，當土壤含水率降低至14.7%時，HN44的MDHAR活性顯著上升，達到峰值。HN44的MDHAR活性上升幅度高于HN65，在處理時間內，兩品種間MDHAR活性差異顯著。由圖5B可知，隨土壤含水率降低，HN44的DHAR活性基本呈先升后降趨勢，HN65的DHAR活性呈升高趨勢。當土壤含水率為24.1%、22.3%、20.8%和20.1%時，HN44和HN65的DHAR活性變化不大，土壤含水率降低至15.5%，即干旱持續(xù)5 d時，DHAR活性迅速升高4.66、4.35倍，差異顯著。

圖4 不同土壤含水率對APX、GR活性的影響Fig.4 Effect on APX and GR activities under different soil water content

圖5 不同土壤含水率對MDHAR、DHAR活性的影響Fig.5 Effect on MDHAR and DHAR activities under different soil water content

2.3 干旱脅迫對大豆葉片T-AOC的影響

由圖6可知，隨土壤含水率降低，HN44和HN65的T-AOC呈升高趨勢。當土壤含水率為24.1%、22.3%、20.8%、20.1%、15.5%和14.7%時，HN44和HN65的T-AOC變化不大，當土壤含水率為14.5%，即干旱持續(xù)7 d時，HN44和HN65的TAOC顯著上升，HN44較HN65高48.59%。在處理時間內，兩品種間T-AOC差異顯著。

2.4 干旱脅迫復水后對大豆葉片ASA-GSH循環(huán)的影響

由表1可知，隨干旱程度加劇，復水后兩品種ASA、GSH含量呈遞增趨勢。ASA、GSH含量在干旱處理前4 d，復水后兩品種變化不大，第5天時，顯著升高。復水后DHA量呈先升后降趨勢，但兩品種均未恢復至對照水平。復水后GSSG含量呈先升后降趨勢，第5天開始下降，兩品種均恢復至對照以下。

由表2可知，隨干旱程度加劇，復水后HN44的APX活性呈先升后降趨勢，各處理APX活性未恢復至對照水平，HN65的APX活性在復水期間呈遞增趨勢，各處理與對照相比，差異顯著，即復水期間HN65的APX活性未恢復至對照水平。復水期間，兩品種GR活性呈升高趨勢，各處理間GR活性差異顯著，未恢復至對照水平。MDHAR、DHAR活性呈遞增趨勢，與對照相比，差異顯著，第5天時，活性顯著上升。

圖6 不同土壤含水率對T-AOC的影響Fig.6 Effect on T-AOC under different soil water content

表1 復水后ASA、DHA、GSH、GSSG含量的變化Table1 Changes of ASA,DHA,GSH and GSSG content after re-watering(nmol·g-1FW)

表2 復水后APX、GR、MDHAR、DHAR活性變化Table2 Changes of APX,GR,MDHAR,DHAR activity after re-watering

3 討論與結論

MDA是膜脂過氧化主要產物，MDA含量變化可衡量逆境脅迫對植物傷害程度，本試驗結果表明，干旱迫使大豆葉片MDA含量增加，加劇過氧化和細胞膜破壞程度，敏感型品種破壞程度顯著大于耐旱型品種，說明耐旱型品種承受干旱能力更強，與杜彩艷研究結果一致[16-18]。

ASA-GSH循環(huán)中相關的抗氧化酶活性及抗氧化物質含量變化可反映大豆品種耐旱能力。發(fā)生脅迫時，植物體內保護酶活性增加，清除多余活性氧，植物抗性增強[19]；APX、MDHAR、DHAR和GR作為ASA-GSH循環(huán)主要酶類，共同清除H2O2，并使ASA和GSH再生[20-21]。本研究結果表明，干旱脅迫時，HN44的APX、MDHAR、DHAR和GR活性呈先升后降趨勢，HN65的APX、MDHAR、DHAR和GR活性呈升高趨勢，升高幅度低于HN44，且APX活性水平遠高于MDHAR、DHAR及GR，表明耐旱型品種清除活性氧能力顯著大于敏感型品種，與Tubeileh等研究結果一致[22]。在干旱脅迫前期，酶活性緩慢升高，當土壤含水率達15.5%，即干旱脅迫5 d時，酶活性迅速上升，表明當大豆遭受嚴重干旱脅迫時，抗氧化酶活性急劇增加，此為大豆適應性反應，但當脅迫程度過大時，活性氧積累過多，產生與清除機制失衡時，酶活性降低。復水后兩品種APX、GR、MDHAR、DHAR活性呈升高趨勢，干旱5 d處理復水時顯著升高，原因為當土壤含水量下降至15.5%以下時，繼續(xù)干旱對大豆造成傷害較大，短期復水難以恢復正常生理狀態(tài)。不同作物對氧化脅迫反應不同，趙宏偉等研究表明，干旱脅迫使水稻APX、DHAR、GR等酶活性顯著增加，復水后APX活性迅速下降，而后活性提高[23-24]。

ASA-GSH循環(huán)參與植物脅迫反應，ASA和GSH是ASA-GSH循環(huán)中兩種重要抗氧化物質，在抵御活性氧使植物免受傷害方面具有重要作用[25]。在ASA-GSH循環(huán)中，APX利用ASA作為電子供體，將H2O2還原為H2O，清除H2O2毒害。由于ASA氧化時形成MDHA不穩(wěn)定，一部分被MDHAR還原成ASA，另一部分被氧化成DHA[26]。本研究結果表明，干旱程度增加導致APX活性增強，加快ASA轉換為DHA速率；MDHAR活性升高，增加細胞ASA供應。當土壤含水率為15.5%，即持續(xù)干旱5 d時，抗氧化物質含量迅速升高，HN44抗氧化物質含量高于HN65，說明黑土條件下土壤含水率到達15.5%時，大豆葉片細胞受損，H2O2含量增加，導致氧化損傷；耐旱型品種調節(jié)能力較強，抵御干旱脅迫能力優(yōu)于敏感型品種。復水后兩品種ASA、DHA、GSH含量升高，而GSSG含量下降至對照以下。玉米[27]、水稻[28-29]等作物相關研究表明，植物體內GSH含量隨干旱脅迫程度加重呈下降趨勢，復水后GSH含量上升，可能為大豆對水分敏感性高于其他作物所致。

通過HN44和HN65總抗氧化能力測定，也明HN44抗氧化能力優(yōu)于HN65，為大豆抗旱品種篩選提供理論依據(jù)。大豆體內抗氧化系統(tǒng)間的相互作用機制、不同脅迫下生理變化及抗氧化分子機制尚待深入研究。

干旱脅迫使大豆葉片中MDA含量、抗氧化物質含量、抗氧化酶活性和總抗氧化能力升高。耐旱型品種MDA含量低于敏感型品種，抗氧化物質含量及抗氧化酶活性高于敏感型品種。復水后ASA、DHA、GSH含量，APX、GR、MDHAR、DHAR活性呈升高趨勢，GSSG含量下降至對照以下。

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