張 通，張家新

（內蒙古農業(yè)大學動物科學學院，內蒙古自治區(qū)動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010018）

幼畜體外胚胎移植（Juvenile In Vitro Embryo Transfer，JIVET）技術是一項重要的繁殖生物技術，其利用幼畜卵巢上儲備的大量卵母細胞生產體外胚胎，具有發(fā)揮優(yōu)秀母畜的繁殖潛能、縮短繁育世代間隔，提高畜群遺傳進展的優(yōu)勢。目前，許多研究機構和企業(yè)利用JIVET技術繁育獲得了健康后代，但羔羊誘導卵泡發(fā)育效果不穩(wěn)定、卵母細胞體外發(fā)育能力差、胚胎產出效率低等問題限制了羊JIVET技術在生產實踐中的利用效率。因此，本文對羊JIVET技術的原理、研究進展以及影響JIVET技術效率的因素加以綜述，以期提高JIVET技術的利用效率，促進其應用。

1 JIVET技術的原理與最新研究進展

自然情況下，每只成年母羊不經激素誘導處理僅可獲得2～8枚卵母細胞，經激素誘導處理后的每只成年羊可獲得10～20枚卵母細胞。然而，幼齡羔羊卵巢上有腔卵泡數量儲備多，下丘腦-垂體-卵巢調控軸機能尚未發(fā)育健全，不具備調控卵泡發(fā)育成熟排卵功能，一般在4～8周齡誘導羔羊卵泡超數發(fā)育。Kennedy等[1]觀察發(fā)現(xiàn)，自然情況下在母羊妊娠135 d左右，綿羊胎兒卵巢上開始出現(xiàn)有腔卵泡，出生后有腔卵泡的數目隨羔羊日齡的增長而逐漸增多，在出生后4～8周齡卵泡數達到高峰。隨著初情期的到來，卵泡數量隨之減少并維持相對穩(wěn)定。Tassell等[2]研究發(fā)現(xiàn)，2周齡時綿羊卵巢上生長卵泡數量最多，4周齡時總卵泡數達到峰值，而且大多數卵泡的直徑小于1.4 mm；4周齡羔羊卵巢上開始發(fā)生卵泡閉鎖的跡象，8～10周齡羔羊卵巢上卵泡閉鎖的數量逐漸增多。由上可知，出生后2～8周齡是羔羊卵泡生長發(fā)育的旺盛階段。

卵泡對促性腺激素反應能力的強弱決定了卵泡是繼續(xù)生長發(fā)育還是閉鎖退化[3]。卵泡生長發(fā)育過程一般要經歷促性腺激素不依賴期和依賴期2個時期。腔前卵泡的生長發(fā)育即原始卵泡生長的啟動和初始卵泡的生長并不完全依賴于促性腺激素，主要靠生長因子的調節(jié)。有腔卵泡的生長發(fā)育則完全依賴于促卵泡素（FSH）和促黃體素（LH）的協(xié)同作用，并且主要受促性腺激素內分泌的調控[4-5]。因為幼齡羔羊卵巢內分泌機制并未發(fā)育健全，且對促性腺激素刺激敏感。目前，利用外源促性腺素誘導4～8周齡羔羊卵泡超數發(fā)育，平均每只供體羔羊可獲得80～100枚卵母細胞[6-8]。盡管外源激素誘導羔羊卵泡超數發(fā)育獲得了豐富的卵源，但羔羊卵母細胞體外發(fā)育能力差、受胎率低仍然是普遍問題。

迄今為止，很多研究者致力于研究成年動物與幼齡動物卵母細胞在細胞形態(tài)[9-10]、基因表達代謝[11-12]和發(fā)育能力[13-14]方面的差異以及整個胚胎體外生產培養(yǎng)體系[15-16]。因此，提高供體羔羊選擇效率，優(yōu)化外源激素誘導卵泡超數發(fā)育的方案，增加供體羔羊卵母細胞的數量，同時提高羔羊卵母細胞質量和體外發(fā)育能力，才能將羊JIVET技術更好地服務于羊產業(yè)。

2 影響JIVET 技術效率的內因

2.1 供體羔羊的選擇 選擇合適的供體羔羊是羔羊誘導卵泡超數發(fā)育的重要環(huán)節(jié)之一[17]，激素敏感的供體羔羊在促性腺激素作用下會產生大量卵泡并產生具有較好發(fā)育能力的卵母細胞。年齡、體重、出生類型和對激素刺激的敏感性是影響JIVET技術穩(wěn)定性的內在因素[18]。Ptak等[19-20]發(fā)現(xiàn)，羔羊卵巢對激素反應的不穩(wěn)定性仍然是影響JIVET 技術效率的主要問題之一，大約20%的羔羊供體對激素處理沒有反應或反應差，而且卵母細胞發(fā)育到囊胚的發(fā)育率很大程度上依賴于供體羔羊，每只供體羔羊提供的胚胎數量在0～55枚[18]。Armstrong等[21]提出，理想的供體羔羊年齡在4～6周齡，該時期供體羔羊卵巢對激素的敏感性最好。O'Brien等[22]表明，激素誘導3～6周齡羔羊獲得卵母細胞的體外發(fā)育能力顯著高于16～24周齡未接受激素誘導的羔羊。此外，Morton等[23]觀察比較了激素刺激3～4周齡和6～7周齡的羔羊，發(fā)現(xiàn)羔羊子宮重量、卵巢重量、卵巢上卵泡數目以及卵母細胞數回收率在2組之間沒有顯著差異，而3～4周齡羔羊卵母細胞的囊胚發(fā)育率（20.4%）顯著低于6～7周齡羔羊（27.9%）。

供體羔羊激素處理前的體重常常作為選擇供體羔羊的指標。Morton等[24]發(fā)現(xiàn)，供體羔羊激素處理前的生長速度和體重與羔羊卵巢增重和卵泡數目無關。然而，Valasi等[25]研究表明，如果誘導卵泡的激素刺激方案調整到適宜羔羊體重的劑量，那么羔羊獲取的卵母細胞數量和質量都可以大大改善。

Kelly等[17]處理6～8周齡供體羔羊時發(fā)現(xiàn)，出生類型也會影響羔羊卵母細胞的發(fā)育能力。激素誘導雌性同胞羔羊獲得囊胚產出效率顯著高于雌雄同胞羔羊。然而，雌雄同胞羔羊的囊胚率（39.5%）與單胎羔羊（34.6%）或三胞胎羔羊（36.5%）沒有顯著差異。由此來看，雌性同胞作供體羔羊有助于提高JIVET的技術效率。

羔羊卵巢對于激素誘導卵泡超數發(fā)育刺激的反應強弱存在個體差異。Morton 等[23]根據3～4周齡羔羊個體對激素刺激反應的強弱分為低反應（小于20個卵泡/卵巢）、中等反應（20～50個卵泡/卵巢）以及高反應（大于100個卵泡/卵巢）3個等級，且3～4周齡和6～7周齡羔羊中，對激素刺激反應差的個體的卵母細胞利用率比中等反應和高反應個體高。但羔羊個體反應能力差的個體囊胚率低[18-19]。此外，為了充分發(fā)揮優(yōu)秀供體羔羊的遺傳優(yōu)勢，采用重復的激素誘導刺激能夠提高單只羔羊提供的卵母細胞總數，然而供體羔羊超數誘導獲得卵母細胞的數量隨誘導處理次數的增加而逐漸減少。陳曉勇等[26]對6～8周齡羔羊首次激素誘導處理，時隔3周再次處理獲得羔羊卵母細胞的數量極顯著低于首次誘導。Valasi等[25]認為，重復誘導卵泡超數發(fā)育獲得卵母細胞數量下降的主要原因是由于卵巢對激素刺激敏感性降低。

目前仍然沒有確切地選擇供體羔羊的特效辦法，但大多數研究者仍然認為4～8周齡羔羊是誘導卵泡超數發(fā)育、獲得較好發(fā)育能力卵母細胞的理想供體。

2.2 羔羊卵母細胞的發(fā)育能力 卵母細胞生長發(fā)育的卵泡內環(huán)境對卵母細胞獲得發(fā)育能力具有重要的影響，卵母細胞一旦脫離卵泡內環(huán)境，其固有的發(fā)育潛能也隨之確定。

從表觀形態(tài)學角度看，與成年羊相比，羔羊誘導卵泡超數發(fā)育獲得的卵母細胞直徑小、顆粒細胞層少、脂滴多。從卵母細胞發(fā)育潛力角度看，卵母細胞直徑與卵母細胞發(fā)育能力息息相關。Anguita等[27]將羔羊卵母細胞按直徑分類（小于 110、110～125、125～135 μm 和大于135 μm），結果表明不同直徑卵母細胞的體外成熟率分別為0、20.7%、58%和78%，第8天的囊胚率分別為0、0、1.95%和12.5%。Leoni等[13]觀察比較了羔羊和成年羊體外成熟24 h的卵母細胞發(fā)育能力 ，結果發(fā)現(xiàn)羔羊卵母細胞的體外成熟率和受精率（分別為95.1%、66.73%）與成年羊（分別為96.7%、70.62%）沒有顯著差異，但與成年羊相比，羔羊卵母細胞的異常受精率高、卵裂率和囊胚率較低，但羔羊囊胚的形態(tài)、囊胚細胞總數和內細胞數占總細胞數比例與成年羊囊胚沒有顯著差異[12,30]。卵母細胞體外成熟歷經一個多階段、復雜的調控過程，涉及細胞核成熟、細胞質成熟以及顆粒細胞與卵母細胞的相互作用。羔羊卵母細胞發(fā)育能力差很大程度上與卵母細胞細胞核與細胞質成熟不同步有關。Palmerini等[10]觀察發(fā)現(xiàn)，雖然大多數羔羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)24 h也能達到成年羊卵母細胞形態(tài)上的成熟狀態(tài)，但羔羊卵母細胞核成熟滯后以及細胞質質量差。Kochhar等[9]提出羔羊卵母細胞需要額外2 h體外成熟才能達到成年羊卵母細胞常規(guī)體外成熟24 h的成熟狀態(tài)。此外，羔羊體外胚胎也表現(xiàn)出發(fā)育遲緩的現(xiàn)象，如2-細胞[28]、4-細胞[18]、囊胚[28]。相反，Morton等[23]認為，羔羊胚胎發(fā)育的速度與成年羊沒有差異，造成發(fā)育速度差異的原因可能是高劑量FSH處理、不同的培養(yǎng)系統(tǒng)或氧濃度的高低。因此，羔羊卵母細胞發(fā)育能力差在很大程度上與其超微結構異常、胞質缺陷、代謝紊亂等導致的核質成熟不同步有關。目前，大多數研究者采用延長羔羊卵母細胞體外成熟時間，進而提高卵母細胞的成熟質量。從基因蛋白水平來看，羔羊卵母細胞全基因組甲基化水平和mRNA儲存量都顯著低于成年羊，甲基化水平的降低會影響某些印記基因的表達，mRNA儲存的貯存不足會影響核質成熟[29-30]。卵丘細胞與卵母細胞之間的聯(lián)接對于卵母細胞成熟期間營養(yǎng)物質的輸送以及蛋白合成至關重要。Ledda等[31]研究發(fā)現(xiàn)，羔羊與成年羊卵母細胞成熟促進因子（Mature Promoting Factor，MPF）的形式與活動水平相似，但羔羊卵母細胞成熟培養(yǎng)后的MPF合成量顯著低于成年羊，這可能與羔羊卵丘細胞和卵母細胞聯(lián)接發(fā)育不完善有關。此外，Leoni等[13]研究證明，與成年羊相比，羔羊卵母細胞具有較少的線粒體以及特殊的線粒體分布模式。因此，卵母細胞內mRNA和蛋白質的儲存以及線粒體活性和分布作為哺乳動物卵母細胞發(fā)育能力的決定因素，最終將影響胚胎的品質。運用現(xiàn)代生物信息學技術分析預測調控卵母細胞發(fā)育能力的相關基因和關鍵通路結合體外生產試驗，對于正確理解羔羊卵母細胞體外核質成熟機制以及解釋羔羊卵母細胞發(fā)育能力下降的原因具有重要意義。

3 影響JIVET 技術效率的外因

3.1 供體羔羊的營養(yǎng) 營養(yǎng)不良會影響成年母羊超數排卵的數量和質量[32]。幼齡羔羊的營養(yǎng)依賴于母體。Kelly等[33]研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期間母羊營養(yǎng)水平的差異直接影響出生后羔羊誘導卵泡超數發(fā)育的效果、卵母細胞質量以及囊胚發(fā)育率。妊娠期間營養(yǎng)水平高，羔羊誘導卵泡超數發(fā)育效果好，胚胎產出率相對也高。Abecia等[34]報道，孕早期營養(yǎng)不良不僅會引起母羊繁殖力和多產性能下降，而且可導致JIVET羔羊誘導卵泡超數發(fā)育獲得卵母細胞數目的下降。因此，供體羔羊的營養(yǎng)水平與健康狀態(tài)一定程度上會影響JIVET技術效率。

3.2 超數誘導卵泡發(fā)育的季節(jié) 成年母羊的超數排卵受繁殖季節(jié)的影響，非繁殖季節(jié)超排效率較低，繁殖季節(jié)超排效率較高。羔羊由于體內的生殖軸并未發(fā)育健全，但對激素刺激反應較為敏感，誘導卵泡超數發(fā)育不受季節(jié)限制。但Gou等[7]用激素誘導處理4～8周齡羔羊，發(fā)現(xiàn)夏季和秋季的卵泡生長發(fā)育顯著優(yōu)于冬季，而且卵母細胞的發(fā)育能力在這3個季節(jié)之間存在極顯著差異。季節(jié)對于JIVET技術效率的影響仍需進一步研究驗證。

3.3 激素誘導處理方案的優(yōu)化 激素處理誘導卵泡超數發(fā)育，不僅誘導增加卵泡的生長，引起卵泡細胞和卵泡內環(huán)境的生化變化，而且激活了卵母細胞內的生物合成過程。另外，激素還可以刺激顆粒細胞中促性腺素受體的增加[35]。

迄今，關于優(yōu)化羔羊誘導卵泡超數發(fā)育的方案已經進行了大量的研究?；诔赡昴秆虺欧桨?，研究者開展了羔羊誘導卵泡超數發(fā)育方案的探究。Ledda等[36]采用孕酮結合促性腺激素，選擇30～40日齡的羔羊進行激素誘導處理，給羔羊陰道埋植海綿栓（體積是成年羊埋栓體積的1/6）6 d，撤栓前36 h一次性分別注射120 IU促性腺激素釋放激素（GnRH）和400 IU孕馬血清促性腺激素（PMSG），撤栓24 h后采卵，平均每只羔羊獲得86.2枚卵母細胞，成熟率為77.9%。Ptak等[18]采用類似的處理方法給1月齡羔羊陰道埋植孕酮栓8 d，從第5、6、7天每天早、晚各注射27 mg FSH，第8天撤栓，平均每只羔羊獲得約29枚卵母細胞，成熟率為49.8%，囊胚率為22.9%。Kelly等[6]采用促性腺素法，一次性肌肉注射l60 mg FSH和間隔12 h等量注射4×40 mg FSH，最后一次FSH注射的同時注射400 IU馬絨毛膜促性腺激素（eCG），發(fā)現(xiàn)分4次等量注射FSH效果優(yōu)于一次性注射，平均每只供體羔羊獲得88枚卵母細胞，卵裂率為77.5%。也有研究發(fā)現(xiàn)，羔羊卵母細胞收集之前用GnRH處理，可促進卵母細胞在體內的成熟發(fā)育，但不影響卵母細胞的收集數量、形態(tài)以及囊胚發(fā)育率[37]。目前，大多數研究者采用等量4×40 mg FSH或者6×40 mg FSH處理方案。

總之，激素刺激增加收集卵母細胞的數量以及提高卵母細胞發(fā)育能力，但激素誘導羔羊卵泡超數發(fā)育的最佳方案以及激素誘導處理對卵母細胞發(fā)育能力的機制尚未明確。

3.4 羔羊體外胚胎的培養(yǎng)體系 目前，羔羊胚胎體外生產所涉及的卵母細胞體外成熟、體外受精、受精卵體外培養(yǎng)等過程的培養(yǎng)體系均基于成年羊體外胚胎生產的培養(yǎng)體系。為提高羔羊卵母細胞和胚胎的體外發(fā)育能力，許多研究者致力于改善優(yōu)化體外胚胎培養(yǎng)體系。Bai等[15]在體外成熟液中添加2-巰基乙醇和半胱氨酸并沒有提高核成熟或微管構型，但改善了精子解聚并提高了囊胚率。L-左旋肉堿及其衍生物乙?；?L-肉堿可以將長鏈脂肪酸轉運到線粒體中，通過β-氧化產生ATP向細胞供應能量[38]。Reader等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在體外成熟液中添加乙?；?L-肉堿可以用于增加羔羊卵母細胞體外胚胎的囊胚率，但對線粒體的體積、數量以及線粒體DNA的拷貝數沒有影響。此外，Catalá等[39]發(fā)現(xiàn)，亮甲酚藍陽性羔羊卵母細胞的發(fā)育能力顯著高于亮甲酚藍陰性羔羊卵母細胞；Wang等[40]提出，在體外成熟之前，用13 μmol/L亮甲酚藍染色羔羊卵母細胞可用于選擇有發(fā)育能力的羔羊卵母細胞。此外，他們建議使用米力農（Milrinone）可以促進羔羊胚胎的體外發(fā)育能力。

目前，盡管在體外培養(yǎng)基中添加抗氧化劑、促生長因子以及抗凋亡劑均能有效提高受精率和胚胎發(fā)育效率，但優(yōu)化改善羔羊卵母細胞體外成熟和胚胎體外培養(yǎng)體系仍有待提高。

4 小 結

目前，國內外JIVET技術領域雖然取得了初步進展，也獲得了一定的推廣應用，但涉及羔羊卵子發(fā)生調控和卵泡發(fā)育機理相關機制的研究進展緩慢。隨著基因組學、蛋白組學、代謝組學和胚胎生物技術研究的迅猛發(fā)展，從各個角度深度解析羔羊卵母細胞與成年羊卵母細胞發(fā)育、成熟和代謝的差異，優(yōu)化JIVET技術激素處理方案和體外培養(yǎng)體系，才能更好地發(fā)揮JIVET技術在羊繁育體系中的作用。

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