周鋒 沙德勝 劉紅

[摘要] 目的 探討Hdm2剪接體促進結(jié)直腸癌細胞增殖的分子機制。 方法 該研究內(nèi)容起止時間：2015年1月—2017年12月。構(gòu)建Hdm2剪接體的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株后進行CCK-8的檢測，并利用western-blot相關(guān)下游蛋白的檢測。結(jié)果Hdm2剪接體與對照組相比可以促進結(jié)腸癌細胞的增殖（P<0.05），p53和p21的表達明顯下降（P<0.05），同時上調(diào)p-p38和p38的表達（P<0.05）。 結(jié)論 Hdm2剪切體與結(jié)腸癌細胞的增殖相關(guān)，其通過下調(diào)抑癌基因p53，p21的表達，激活p-p38和p38的表達促進結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)直腸癌；Hdm2剪切體；mRNA；p53

[中圖分類號] R735.34 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2018）10（c）-0001-04

[Abstract] Objective To investigate the molecular mechanism of Hdm2 splice promoting proliferation of colorectal cancer cells. Methods The start and end time of this study： from January 2015 to December 2017. The stable cell line of Hdm2 splice was constructed and tested for CCK-8， and the detection of downstream proteins related to western-blot was used. Results Hdm2 splices promoted the proliferation of colon cancer cells compared with the control group（P<0.05）， and the expression of p53 and p21 decreased significantly （P<0.05）， expression of p-p38 and p38 （P<0.05）. Conclusion Hdm2 splicing is associated with the proliferation of colon cancer cells， which promotes the development and progression of colorectal cancer by down-regulating the expression of p53， p21 and activating p-p38 and p38.

[Key words] Colorectal cancer； Hdm2 splicing； mRNA； p53

結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)高發(fā)的惡性腫瘤之一，據(jù)最新統(tǒng)計資料顯示，全球范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率在男性患者中列第3位（10.0%），在女性患者中列第2位（9.2%）[1]，并以每年超過100萬例新增病例的速度遞增，嚴重影響著人們的生命健康與生活質(zhì)量。外界多種因素的作用導(dǎo)致正常上皮細胞遺傳學(xué)或表觀遺傳學(xué)的改變，被認為是導(dǎo)致結(jié)直腸癌的主要原因，進一步基因突變和微環(huán)境改變加劇了結(jié)直腸癌的惡性程度。因此，深入研究結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制對明確其致病機理、早期診斷及臨床治療有重要意義。

Hdm2 是公認的致癌基因，位于人類基因染色體12q13-14，可以降解p53蛋白導(dǎo)致其抑癌功能失去[2-4]。早期關(guān)于Hdm2的研究發(fā)現(xiàn)，其mRNA具有多種剪接方式，在腫瘤的細胞系中頗為常見。異常剪接會造成基因轉(zhuǎn)錄的中段，其原因為成熟的mRNA中的外顯子丟失，或者不可避免地將無義密碼子引入而改變了讀碼框。其中Hdm2最常見的一種剪切形式是缺失第四，第五，第六外顯子，截短的Hdm2蛋白產(chǎn)物僅包含p53結(jié)合域[5-7]。在細胞受到遺傳毒性和致癌毒性后，Hdm2 mRNA剪切形式發(fā)生變化。然而Hdm2的選擇性剪切的原因及造成的結(jié)果并不清楚。前期研究發(fā)現(xiàn)Hdm2的10號外顯子和11號外顯子在DNA損傷時會插入一段108bp序列（見圖1）。插入的片段還有終止密碼子，導(dǎo)致了11號和12號外顯子的缺失。然而這兩個外顯子導(dǎo)致的結(jié)果并不是很清楚。該研究于2015年1月—2017年12月構(gòu)建了Hdm2的插入108bp片段（Hdm2-S）的過表達慢病毒，研究闡明了這種選擇性剪接在結(jié)直腸癌細胞中的功能及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞 人結(jié)腸癌野生型細胞株SW1116，Caco-2，HT29，Hct116和293T購于中國科學(xué)院上海細胞所。

1.1.2 實驗試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、雙抗、胎牛血清（FBS）購于美國Gibco公司；BCA蛋白定量試劑盒、PMSF、SYBR green熒光染料、Taq酶，聚丙烯酰胺預(yù)制梯度凝膠等購于Invitrogen公司；DNA 限制性內(nèi)切酶，T4連接酶購自NEB公司；實驗用蛋白檢測抗體均購于CST公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 分子生化實驗設(shè)備：高速離心機、臺式離心機、三聯(lián)式水浴鍋、移液槍、PCR擴增儀、電子天平、pH酸堿值測定儀、BIO-RAD電泳儀、BIO-RAD垂直電泳槽、水平電泳槽、Tanon紫外凝膠成像儀、Odyess熒光掃描儀、生物通風(fēng)柜、水平搖擺儀、恒溫培養(yǎng)箱、高壓鍋。

細胞培養(yǎng)設(shè)備：生物安全柜、電動移液器、恒溫水浴鍋、低溫冰箱、超低溫冷柜、臺式低速離心機、振蕩儀、Olympus倒置式熒光纖維鏡、細胞培養(yǎng)箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將細胞株SW1116和293T分別培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，下傳代至對數(shù)生長期后進行試驗。SW1116細胞建立的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，培養(yǎng)條件不變。以上培養(yǎng)均在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 構(gòu)建質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染 構(gòu)建Myc或Flag標簽的Hdm2和Hdm2-S質(zhì)粒。質(zhì)?？寺【约毎鹀DNA作為模板，利用高保真Pfu DNA 聚合酶（Agilent， Ultra II）進行PCR，使用的內(nèi)切酶購于NEB公司。自行構(gòu)建質(zhì)粒克隆引物如下。

Myc-Hdm2：

F（BamH1）：5'-CGGGATCCCGATGGAACAGAAAC TGATCTCTGAAGAAGACCTGATGTGCAATACCAACAT GTCT GTACCTACTG-3'

R（EcoR1）：5'-CCGGAATTCCGGCTAGGGGAAATA AG TTAGCACAATC-3'

Flag- Hdm2-S

F（BamH1）：5'-CGGGATCCCGATGGAGCGGTTAGGAGAGAA-3'

R（EcoR1）：5'-CCGGAATTCTCAGTTATAGAATGAT TTCT-3'

SW1116細胞長到80%～90%時，利用Lipofectamine 2000（Invitrogen）進行細胞轉(zhuǎn)染實驗。首先取Opti-MEM（Gibco）500 μL放入1.5 mL離心管，隨后加入質(zhì)粒和Lipofectamine2 000，比例為1：3，每轉(zhuǎn)染1 μg質(zhì)粒，加入3 μL 的Lipofectamine2 000，混勻后室溫放置30 min后，加入SW1116細胞中。利用完全培養(yǎng)基（DMEM+10%血清+雙抗）補足。24 h后更換完全培養(yǎng)基（DMEM+10%血清+雙抗）。

1.2.3 慢病毒包裝及穩(wěn)轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細胞系的建立 慢病毒的包裝：10 cm培養(yǎng)皿培育293T細胞，細胞密度達到90%后，利用LIP2000進行質(zhì)粒（病毒載體質(zhì)粒5 μg，相應(yīng)的包裝質(zhì)粒各2.5 μg）轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體和質(zhì)粒的比例為1∶3?；旌? h后更換新鮮培養(yǎng)基8 mL，待48 h后收集病毒上清，利用0.22 μm的濾膜過濾后， -80℃保存。

感染結(jié)腸癌細胞株：當(dāng)結(jié)腸癌細胞密度達到80%滿盤時，取5 mL病毒上清加入細胞培養(yǎng)皿中，為了增加感染效率同時加入終濃度為5 μg/mL的polybrene，感染24 h后，更換含有10%的胎牛血清的培養(yǎng)基。隨后加入終濃度3 μg/mL的嘌呤霉素進行陽性細胞的藥篩。隨后通過基因水平及蛋白水平檢測鑒定穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。

1.2.4 Real-Time PCR檢測目的基因表達 根據(jù)NCBI提供的Hdm2（NM_002392.5）和Hdm2-S （NM_0011453 40.2）的mRNA序列設(shè)計檢測引物。隨后利用TRZOL試劑提取穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞的總RNA，利用cDNA合成第一鏈試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA。空載病毒質(zhì)粒的SW1116細胞作為對照，β-actin作為PCR的內(nèi)參。使用美國ABI公司FAST7500型熒光定量PCR儀，加入SYBR熒光染料，進行Real-Time PCR。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min預(yù)變性， 94℃ 30 s， 55℃ 30 s， 72℃ 30 s共進行40個循環(huán)，以2-ΔΔCT值評估相對表達量。每組實驗設(shè)置3個復(fù)孔。

1.2.5 細胞活性檢測（Cell Counting Kit-8， CCK-8） CCK-8檢測試劑盒購自日本DOJINDO公司。將實驗組及對照組細胞分別接種到96孔板中，每孔100 μL，大約105細胞。放在細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)（在37℃，5%CO2）。檢測時每孔加入10 μL的CCK-8溶液，放置2 h后用酶標儀測定450 nm處的吸光度。

1.2.6 統(tǒng)計方法 用2-△△ct法處理實時熒光定量RT-PCR所得的ct數(shù)據(jù)，采用SPSS 15.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理獲得的數(shù)據(jù)，由于實驗組標本2-△△ct值不符合正態(tài)分布，以2個獨立樣本檢驗進行統(tǒng)計分析；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢測Hdm2和Hdm2-S在結(jié)腸癌中的表達

利用PCR分別檢測Hdm2和Hdm2-S在結(jié)腸癌細胞株HCT116，SW1116，Caco-2和HT29的表達。結(jié)果顯示，Hdm2在SW1116和HCT116中表達最低，而在Caco-2和HT29的表達高。Hdm2-S在SW1116中表達最低，而在HCT116，Caco-2和HT29的表達高。綜合以上結(jié)果，選取了SW1116進行下一步研究。以上實驗差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

2.2 構(gòu)建Hdm2和Hdm2-S在SW1116結(jié)腸癌中的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株

轉(zhuǎn)染帶有標簽的慢病毒Lenti-myc- Hdm2和Lenti-flag-Hdm2-S構(gòu)建Hdm2和Hdm2-S過表達Sw1116細胞株，與對照組相比，Hdm2和Hdm2-S的mRNA水平顯著升高（圖3A）。Hdm2和Hdm2-S的蛋白表達水平也有表達（圖3B），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 Hdm2和Hdm2-S對結(jié)腸癌細胞增殖能力的影響

利用CCK-8實驗研究過表達Hdm2和Hdm2-S對結(jié)腸癌細胞株增殖能力的影響。研究發(fā)現(xiàn)48 h之前沒有顯著性差異，在48 h以后Hdm2-S增殖能力強于Hdm2，而Hdm2增殖能力顯著強于對照組。差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖4。

2.4 Hdm2和Hdm2-S 對結(jié)腸癌細胞p53，p21，p38和p-p38表達水平的影響

利用Western-blot檢測過表達Hdm2和Hdm2-S和對照組的p53，p21，p38和 p-p38的蛋白表達水平變化。與對照組相比Hdm2和Hdm2-S在SW1116細胞中p53蛋白水平明顯降低，尤其Hdm2-S差異更明顯。與對照組相比Hdm2和Hdm2-S在SW1116細胞中p21蛋白水平明顯降低，尤其Hdm2-S差異更明顯。與對照組相比Hdm2和Hdm2-S在SW1116細胞中p38和P-p38蛋白水平明顯升高，其中Hdm2-S的P-p38表達最高。以上實驗差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖5。

3 討論

結(jié)直腸癌是發(fā)病率在全球癌癥中位居第三位，致死率在全球癌癥中位居第四位[1]。研究發(fā)現(xiàn)基因的選擇性剪切與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。Hdm2是一個癌基因，由12個外顯子構(gòu)成，第1號和第2號外顯子是調(diào)節(jié)翻譯速率的非編碼區(qū)，第3～12號外顯子包含編碼序列。其功能主要通過泛素化降解抑癌基因P53蛋白[5，8-9]。Hdm2在多個腫瘤中過度表達，其表達上調(diào)被認為是p53失活的主要原因。然而目前很多研究發(fā)現(xiàn)Hdm2的功能不僅與p53的降解相關(guān)，它本身mRNA的選擇性剪切與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[10-11]。目前研究發(fā)現(xiàn)在遺傳毒性作用下，Hdm2的選擇性剪切會發(fā)生改變，產(chǎn)生新的剪切體，而某些形式的高表達可能具有致癌性質(zhì)。目前報道有5種Hdm2剪接子，主要包括Hdm2WT；Hdm2 Δ6；Hdm2 Δ3-6；Hdm2 Δ6-9和 Hdm2 Δ4-9[6， 12，-13]。按照功能分為兩種，一種是含有p53結(jié)構(gòu)域，例如：Hdm2WT；Hdm2 Δ6和Hdm2 Δ6-9；另一種是含C末端RING結(jié)構(gòu)域，如：Hdm2 Δ3-6和Hdm2 Δ4-9。Hdm2 Δ6在軟組織肉瘤、乳頭狀甲狀腺瘤中高表達，并且與不良預(yù)后有關(guān)[14]。Hdm2 Δ6與p53緊密結(jié)合，其結(jié)合作用比Hdm2WT更強，可以抑制p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性并抑制細胞凋亡。與Hdm2 Δ6相似，其缺失造成終止密碼子提前出現(xiàn)，Hdm2 Δ4-9僅保留了p53結(jié)合區(qū)域，其與p53結(jié)合能力更強。Hdm2 Δ4-9表現(xiàn)為p53結(jié)合區(qū)域的缺失，它通過結(jié)合Hdm2抑制p53的降解從而穩(wěn)定p53功能[15]。

該次的研究發(fā)現(xiàn)Hdm2-S是在10號外顯子后插入了一段108bp的片段，其中包含有終止密碼子。不同于之前的報道，由于Hdm2-S缺失了第10號和第11號外顯子，即缺失了C末端RING結(jié)構(gòu)域。然而讓我們困惑的是在Hdm2-S過表達細胞中，p53的表達與對照組相比明顯降低，并且其下游蛋白p21表達顯著降低，關(guān)于為何Hdm2-S可以減少p53的表達將進一步研究。同時利用CCK-8研究發(fā)現(xiàn)Hdm2-S過表達組可以促進SW1116的增殖，并且與Hdm2過表達組相比有顯著增強，這個研究與抑癌基因P53和P21的抑制結(jié)直腸癌細胞增殖相一致[16]。p38及p-p38的激活和結(jié)腸癌的增殖密切相關(guān)[17]，于是進一步檢測了p38及p-p38的表達，研究發(fā)現(xiàn)Hdm2-S組明顯可以激活p-p38和p38，這也初步解釋了Hdm2-S促進結(jié)直腸癌增殖的分子機制。該研究闡明了Hdm2-S剪切體在結(jié)直腸癌細胞中的作用，為治療結(jié)直腸癌提供了新的靶點，進而為Hdm2選擇性剪切的功能提供了新的理論和實驗依據(jù)。

[參考文獻]

[1] Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Global cancer statistics，2012[J].CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87-108.

[2] Individualized prediction of perineural night in colorectal cancer： development and validation of a radiomics prediction model[J].Journal of cancer research in China （English editio n），2018，9（1）：40-50.

[3] Pathologic response after preoperative therapy predicts progn osis of Chinese colorectal cancer patients with liver metasta ses[J].Cancer （English edition），2017，3（11）：537.

[4] Wachter F，Morgan AM，Godes M，et al.Mechanistic validation of a clinical lead stapled peptide that reactivates p53 by dual HDM2 and HDMX targeting[J].Oncogene，2017，36（15）：2184-2190.

[5] Synthetic lethal short hairpin RNA screening reveals that ring finger protein 183 confers to hold to trametinib in colorectal cancer cells[J].Cancer （English edition），2017，8（12）： 726.

[6] Knockdown of GRHL3 Inhibits Activities and Induces Cell Cycle Arrest and Apoptosis of Human Colorectal Cancer Cells [J].Journal of huazhong university of science and technology （medical English German），2017，4（6）：880.

[7] Spatio - temporal analysis of the incidence of colorectal cancer in through，2010-2014[J].Cancer （English edition），2017，2 （10）：516.

[8] Liu N，Zhang J，Yang X，et al.HDM2 Promotes NEDDylation of Hepatitis B Virus HBx To Enhance Its Stability and Function[J].J Virol，2017，91（16）：JVI.00340-17.

[9] Liu S，Tackmann NR，Yang J，et al.Disruption of the RP-MDM2-p53 pathway accelerates APC loss-induced colorec tal tumorigenesis[J].Oncogene，2017，36（10）：1374-1383.

[10] An T，Gong Y，Li X，et al.USP7 inhibitor P5091 inhibits Wnt signaling and colorectal tumor growth[J].Biochem Pharm- acol，2017，131：29-39.

[11] Yu Z，Zhang B，Cui B，et al.Identification of spliced variants of the proto-oncogene HDM2 in colorectal cancer[J].Cancer，2012，118（4）：1110-1118.

[12] Clinicopathologic features and treatment efficacy of Chinese patients with BRAF - mutated metastatic colorectal cancer： a retrospective observational study[J].Cancer （English editi- on），2017，13（11） ： 626-634.

[13] A retrospective analysis of the safety and efficacy of apatinib in treating advanced metastatic colorectal cancer[J].Journal of oncology and translational medicine （in English），2017，9（5）：210.

[14] Soluble Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells - 1 and Inflammatory Markers in Colorectal Cancer Surgery： A Prospective Cohort Study[J].Journal of the Chinese medi- cal journal （English edition），2017，13（22）：2691.

[15] Inoue K，F(xiàn)ry EA，F(xiàn)razier DP.Transcription factors that interact with p53 and Mdm2[J].Int J Cancer，2016，138（7）：1577-1585.

[16] Luo Z，Zheng K，F(xiàn)an Q，et al.Hyperthermia exposure induces apoptosis and inhibits proliferation in HCT116 cells by upregulating miR-34a and causing transcriptional activation of p53[J].Exp Ther Med，2017，14（6）：5379-5386.

[17] Shen LT，Chou HE，Kato M.TIF1β is phosphorylated at serine 473 in colorectal tumor cells through p38 mitogen-activated protein kinase as an oxidative defense mechanism[J].Biochem Biophys Res Commun，2017，492（3）：310-315.

（收稿日期：2018-07-21）