黃小昆，龍 海，蘇錫雄，楊艾梅，李自安，余 璞，王 強(qiáng)，劉菊芬，王金祥，潘興華，龐榮清，許立奇

宮內(nèi)干細(xì)胞移植（inuterostemcelltransplantation）是建立嵌合體模型的有效方法，比如Flake等[1]和黃淑幀等[2]課題組就采用B超引導(dǎo)下胎羊腹腔內(nèi)注射人造血干細(xì)胞的方法成功建立了人-羊嵌合體模型，并證實(shí)移植的人源細(xì)胞可在嵌合體動(dòng)物肝臟等多個(gè)組織器官中廣泛存在[3]。如果采用宮內(nèi)干細(xì)胞移植的方法將干細(xì)胞直接注射到胎羊肝臟，理論上來(lái)說(shuō)將非常有利于嵌合體肝臟的形成。因此，本研究探索B超引導(dǎo)下定位注射干細(xì)胞到山羊胎肝的技術(shù)方法，為通過(guò)宮內(nèi)干細(xì)胞移植途徑建立嵌合體模型并開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、材料和儀器 DMEM/F-12培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清和0.25%胰蛋白酶（均為BI公司）；倒置熒光相差顯微鏡（NIKON公司）、熒光顯微鏡（Lwica DMI3000B）、流式細(xì)胞儀（BD 公司）；超聲波穿刺針（CREATE MEDIC株式會(huì)社）；B型超聲多普勒（PHILIPSIU22）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1月齡雄性云南烏骨山羊1只，疑似懷孕1.5～3個(gè)月的云南烏骨母山羊10只，均來(lái)源于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備 于1月齡雄性山羊髂骨后棘處無(wú)菌穿刺針采集1～2 ml肝素抗凝骨髓。參照課題組建立的分離培養(yǎng)方法分離間充質(zhì)干細(xì)胞[4]，即在無(wú)菌條件下，以1000 r/min離心3 min,漂洗后用含10%胎牛血清的DMEMF12培養(yǎng)液重懸骨髓細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，適時(shí)換液并傳代。

1.3.2 懷孕山羊的鑒定 疑似懷孕母羊10只，禁食禁水12 h，腹部備皮后固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，B超探查確定胎兒的存在，觀察胎兒數(shù)量、胎兒性別和發(fā)育狀況。

1.3.3 超聲引導(dǎo)下山羊胎肝穿刺和定位注射 在母羊懷孕約3個(gè)月時(shí)，將超聲探頭置于懷孕山羊腹部，確定胎羊位置及穿刺點(diǎn)，然后利多卡因局部浸潤(rùn)麻醉預(yù)穿刺點(diǎn)，調(diào)整超聲探頭角度，固定消毒后的固定架于超聲探頭，將無(wú)菌穿刺針置于固定架穿刺孔，小心刺入母羊腹壁并進(jìn)入胎肝，拔出針芯連接備有細(xì)胞的注射器，注射細(xì)胞后拔出穿刺針，壓迫止血。注射完畢，將母羊置于圈舍精心飼養(yǎng)，觀察胎羊出生與流產(chǎn)情況。注射方案見(jiàn)表1。

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備 采用髂骨后棘穿刺法可一次性獲得骨髓至少0.5 ml，采用全骨髓培養(yǎng)法，即采用含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞并靜置培養(yǎng)的方法，可以在10 d內(nèi)觀察到很多長(zhǎng)梭狀貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞（圖1A），傳代后可獲得密集排列呈旋渦狀生長(zhǎng)的細(xì)胞（圖1B）。傳代5代即可獲得滿足實(shí)驗(yàn)需要量，用生理鹽水懸浮細(xì)胞并調(diào)整濃度為2.1×107cell/ml的懸液備用。

圖1 山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（4×10）

2.2 懷孕山羊的準(zhǔn)備 借助B超，可以清晰觀察到懷孕1.5～3個(gè)月的母羊腹腔臟器分布和胸腔輪廓清晰的胎羊，并可觀察到明顯的胎心收縮和舒張以及動(dòng)態(tài)血流影像甚至胎動(dòng)（圖2A），可監(jiān)聽(tīng)到節(jié)律整齊的心音（圖2B）。10只交配后疑似懷孕1.5～3個(gè)月的母羊中有6只懷孕，其中，5只懷有1胎，1只懷有2胎，7只胎羊性別為雌性4只，雄性3只。

2.3 胎肝內(nèi)定位注射 在B超顯像下，可清晰觀察到胎心節(jié)律性跳動(dòng)，以此可確定位于胎心旁的胎肝位置，通過(guò)觀察肝臟形態(tài)及血流動(dòng)態(tài)即可準(zhǔn)確識(shí)別并確定胎肝的位置（圖3A）。調(diào)整超聲探頭及固定架的角度確保穿刺針進(jìn)針?lè)较蛘_之后，通過(guò)超聲動(dòng)態(tài)現(xiàn)象可以清晰顯示進(jìn)針位置（圖3B），避開(kāi)血管，觀察推入少許氣泡后白色亮點(diǎn)的存在和位置（圖3C），即可準(zhǔn)確定位穿刺針針尖的位置處于胎肝實(shí)質(zhì)區(qū)域。連接備有間充質(zhì)干細(xì)胞懸液的注射器，即可將1 ml或4 ml的間充質(zhì)干細(xì)胞懸液準(zhǔn)確注入胎肝實(shí)質(zhì)區(qū)域。

2.4 懷孕母羊的觀察與流產(chǎn) 胎羊肝臟接受定位注射生理鹽水懸浮的雄性山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液后得到結(jié)果見(jiàn)表1，其中A組2只肝臟注射了1ml（含2.1×107個(gè)細(xì)胞）的雌性胎羊順利出生，其中之一為雙胞胎的雌性胎羊接受注射而另一只雄性胎羊沒(méi)有注射均順利出生。B組注射了相同容積但4倍數(shù)量的細(xì)胞的胎羊也順利出生，這4只母羊穿刺后飲食正常，精神狀態(tài)良好，最終順利產(chǎn)下了5只發(fā)育良好的羊羔。C組2只懷孕母羊的胎肝內(nèi)注射了4倍容積但與B組相同數(shù)量的細(xì)胞，3 d后母羊精神萎靡嗜睡，分別于穿刺后第8天和第10 d發(fā)生流產(chǎn)，產(chǎn)下了死胎，母羊存活。

3 討論

圖2 懷孕母羊診斷的超聲影像圖

圖3 胎肝內(nèi)定位注射超聲影像圖

表1 超聲引導(dǎo)下不同注射方案和產(chǎn)羔結(jié)果

B超顯像不但能夠獲得組織器官的解剖圖，顯示器官的外形、內(nèi)部回聲，而且還可以顯示動(dòng)態(tài)臟器的結(jié)構(gòu)和功能[5]，也可用于對(duì)妊娠期產(chǎn)婦甚至產(chǎn)時(shí)進(jìn)行胎心監(jiān)護(hù)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)胎兒生理發(fā)育狀況[6-7]。本研究結(jié)果顯示，1.5個(gè)月以上的胎羊均可在B超顯像條件下清晰地觀察到胎心的跳動(dòng)和心音、顯示胎肝位置及肝臟血流動(dòng)態(tài)位置。宮內(nèi)干細(xì)胞移植是建立嵌合體模型的有效方法，借助B超，可以準(zhǔn)確診斷懷孕1.5個(gè)月以上母羊懷的是單胎還是雙胎及胎羊性別，并可準(zhǔn)確定位所需穿刺點(diǎn)。懷孕單胎山羊適于精確定位注射建立嵌合體模型，懷孕雙胎山羊適于開(kāi)展干細(xì)胞遷移與分化的實(shí)驗(yàn)研究，胎羊性別的確定有助于進(jìn)行性別錯(cuò)配設(shè)計(jì)便于嵌合體鑒定分析。

云南烏骨山羊性情溫順，通常懷有單胎，孕期5個(gè)月，體型中等，腹壁皮下脂肪少，便于開(kāi)展嵌合體研究。本研究顯示：在B超引導(dǎo)下可以準(zhǔn)確確定1.5月齡以上胎羊肝臟位置并準(zhǔn)確穿刺注射BMSC細(xì)胞懸液到胎肝實(shí)質(zhì)區(qū)域。注射1 ml細(xì)胞懸液的條件下，BMSC數(shù)量增加4倍不會(huì)導(dǎo)致胎羊流產(chǎn)，但BMSC數(shù)量不變，注射4 ml體積的細(xì)胞懸液則100%（2/2）導(dǎo)致流產(chǎn)，這說(shuō)明發(fā)育過(guò)程中的烏骨山羊胚胎可以接受大量同種MSC但不能接受大容積的細(xì)胞懸液，這可能與注射過(guò)多體積的生理鹽水細(xì)胞懸液進(jìn)入胎肝、改變了胚胎發(fā)育的內(nèi)環(huán)境有關(guān)。超聲引導(dǎo)下將間充質(zhì)干細(xì)胞移植到胎肝內(nèi)，是一種無(wú)需手術(shù)的定位穿刺移植方法，可多次注射，是制備嵌合體肝臟的理想技術(shù)方案。本研究為嵌合體肝臟制備及肝病的發(fā)病機(jī)制、藥物代謝以及干細(xì)胞體內(nèi)分化的研究提供了模型基礎(chǔ)。

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