白盈盈，劉菊芬，張建平，和法蓮，陳慧芬，張夢圓，王穎翠，潘興華，劉高米洋

動脈粥樣硬化（AS）是冠心病、心肌梗死、腦栓塞、血栓栓塞性疾病等多種缺血缺氧性心腦血管疾病的重要病理生理基礎，嚴重危害人類健康，是人類死亡的主要原因[1]。隨著人們生活水平和生活方式的改變，加之AS發(fā)病機制尚未完全清楚，無法確定有效的臨床治療方法，AS發(fā)病率逐漸上升，且年輕化，急需開拓新的治療方法。間充質干細胞(MSC)移植治療是近年新興起的一種全新的治療手段，研究發(fā)現(xiàn)，MSC可分化成內皮細胞、釋放多種因子，且本身免疫原性較低，在AS的發(fā)生、發(fā)展中具有一定作用，為AS的治療提供了新的思路。本研究旨在觀察BMSC對ApoE-/-缺陷小鼠動脈粥樣硬化模型的治療效果，為BMSC治療AS提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與器材 DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），胎牛血清（美國 BI公司），雙抗（美國BI公司），百萬層級層流超凈工作臺（SW-CL-2F型，蘇州佳寶凈化工程設備有限公司），細胞培養(yǎng)孵箱（美國 Thermo公司），PCR 儀（Bio-rad公司）。

1.2 實驗動物及分組 6 w齡ApoE-/-缺陷小鼠（品系C57BL/6）和C57BL/6小鼠均購自南京君科生物科技有限公司[合格證號：SCXK（軍）2012-007]，用于制備BMSC的6 w齡C57熒光小鼠為本實驗室提供。所有實驗用小鼠均在SPF級環(huán)境飼養(yǎng)，其中ApoE-/-小鼠從6 w齡開始給予高脂飼料，其余普通飼料喂養(yǎng)。C57BL/6 小鼠為正常對照組（n=8），ApoE-/-缺陷小鼠隨機分為空白對照組（n=8）、陰性對照組（n=4）和實驗組（n=4）。實驗組從第9 w開始經(jīng)尾靜脈注射 1 ×105BMSC 200 μl，1 次/w，共注射 8 次；正常對照組和空白對照組不做處理，于12 w時2組分別處死4只進行模型鑒定；陰性對照組給予注射等體積生理鹽水。BMSC注射4 w后即21 w時，剩余小鼠同時處死、采血、取材。

1.3 BMSC細胞分離與培養(yǎng) 取C57熒光小鼠脫頸處死，無菌取脛骨和股骨骨髓，用培養(yǎng)基稀釋后接種于10 cm2塑料培養(yǎng)皿中，置于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72 h后首次全量換液去除未貼壁細胞，繼續(xù)培養(yǎng)至 90%融合時，常規(guī)傳代培養(yǎng)至第3代，收集細胞，進行細胞計數(shù)，配制成1×105細胞/200μ l的細胞懸液。

1.4 AS模型鑒定及療效評價 空白對照組和正常對照組小鼠于12 w齡時進行基因型鑒定、血脂分析和主動脈弓斑塊形成鑒定，實驗組和陰性對照組于BMSC注射后4w時進行療效評價。具體方法是：（1）基因型鑒定：剪取3～5 mm鼠尾，加入鼠尾裂解液裂解，提取DNA；PCR擴增，引物由昆明碩擎生物科技有限公司合成，上游引物：5'-GCC TAG CCG AGG GAG AGC CG-3'，下游引物： 5-'TGT GAC TTG GGA GCT CTG CAG C-3'（ ApoE 野生型），5-'GCC GCC CCG ACT GCA TCT-3'（ApoE突變型）。 PCR 擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳，通過電泳條帶判斷是否為ApoE缺陷小鼠。（2）血脂分析：小鼠雙側內眥靜脈采血，用自動生化分析儀測定 TC、TG、HDL-C和LDL-C。（3）斑塊形成鑒定：采用主動脈弓油紅O染色法。脫臼法處死陰性對照組小鼠，分離主動脈弓，縱向剖開，4%多聚甲醛4℃固定過夜，用1×PBS沖洗2次，加入油紅O染料工作液（油紅O儲存液：蒸餾水=3∶2，混勻后用中性濾紙過濾）4℃過夜，75%乙醇漂洗3次，5 min/次。 倒置顯微鏡下觀察粥樣斑塊的數(shù)量、面積。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ApoE缺陷AS模型鑒定 瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，空白對照組小鼠PCR產物均僅有245 bp的條帶，均為 APOE 突變型小鼠（圖 2a）。 TC、TG、LDLC檢測結果顯示，空白對照組以上指標較正常對照組明顯升高（P＜0.05，表1）。空白對照組可見Apoe-/-小鼠動脈內壁有紅色脂肪性斑塊形成，粘附在血管壁上（圖2b），正常對照組無紅色斑塊樣結構。結果表明ApoE-/-小鼠高脂飲食至12 w時出現(xiàn)AS的典型特征，即血脂水平升高，動脈出現(xiàn)不規(guī)則斑塊。

圖2 ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型鑒定

2.2 血脂水平比較 實驗組TC、TG、LDL-C較陰性對照組下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），HDL-C各組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），結果見表1。油紅O染色顯示，實驗組斑塊較陰性對照組面積、數(shù)量均有一定程度的減少（圖3），但未達到正常對照組（圖2c）效果，提示BMSC對AS有一定的治療效果。

圖3 BMSC抑制AS模型小鼠主動脈弓斑塊形成

3 討論

目前，國內外關于AS的發(fā)病機制有脂質浸潤學說、血管平滑肌細胞克隆學說、氧化應激學說、免疫功能異常學說、炎癥學說等[2]。研究顯示，血管壁內皮損傷是引起AS的首要因素，同時炎癥反應參與了AS的發(fā)生、發(fā)展[3]。此外，血管中膜平滑肌細胞受到各種病理刺激可遷移進入內膜，然后聚集、增殖為AS中的平滑肌細胞，參與AS的形成[4]。Glass等[5]研究認為，AS是一種自身免疫性疾病，免疫細胞、因子及免疫反應在AS的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，MSC可以向損傷的內皮募集，進一步分化為內皮細胞修復受損的血管內皮，也可通過本身的歸巢作用到達血管損傷部位，參與AS的形成[6]。外源性輸入的MSC可在體內分化為平滑肌細胞，參與血管再狹窄及AS的發(fā)生[7]。

本研究結果顯示，同種異體BMSC經(jīng)靜脈移植到ApoE-/-小鼠體內后，TC、TG及LDL-C下降，且動脈粥樣硬化斑塊的數(shù)量及面積均有減少，提示同種異體BMSC可能具有治療AS的作用。王治校等[8]利用MSC治療小鼠動脈粥樣硬化模型后發(fā)現(xiàn)，在動脈粥樣硬化斑塊面積減小的同時，外周血中免疫細胞數(shù)量增加，認為MSC減輕動脈粥樣硬化可能與其免疫調節(jié)相關。其機制可能是BMSC可歸巢到損傷部位并分化為血管細胞，同時還可分泌多種因子，促進損傷修復和抑制炎癥反應。

綜上所述，ApoE-/-缺陷小鼠用于動脈粥樣硬化相關研究，同時同種異體BMSC可以抑制ApoE-/-動脈粥樣小鼠斑塊形成，改善血脂水平，延緩動脈粥樣硬化進展。

表1 各組血脂水平比較(n=4)

[1] GK Hansson.Inflammation,atherosclerosis,and coronary artery disease[J].N Engl J Med,2009,352(16):429-430.

[2] 劉俊田.動脈粥樣硬化發(fā)病的炎癥機制的研究進展[J].西安交通大學學報（醫(yī)學版）,2015(2):141-152.

[3] Ross R.Atherosclerosis:an inflammatory disease[J].N Engl J Med,1999,340(2):115-126.

[4] Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis:aperspective for the 1990s[J].Nature,1993,362(6423):801-809.

[5] CK Glass，JL Witztum.Atherosclerosis:the road ahead[J].Cell,2001,104(4):503.

[6] WangCH,CherngWJ,YangNI, et al.Late-outgrowth endothelial cells attenuate intimal hyperplasia contributed by mesenchymal stem cells after vascular injury[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2008,28(1):54-60.

[7] Karp JM,Leng Teo GS.Mesenchymal stem cell homing:the devil is in the details[J].Cell Stem Cell,2009,4(3):206-216.

[8] 王治校,毛山,李玉,等.間充質干細胞移植對小鼠動脈粥樣斑塊形成的影響[J].細胞與分子免疫學雜志,2012,28(3):244-246.