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(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)， 蘭州 730000)

鐵棒錘種子為毛茛科烏頭屬植物鐵棒錘(AconitumpendulumBusch.)和伏毛鐵棒錘(A.flavumHand.Mazz.)的干燥成熟種子。其塊根被《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(藏藥)》[1]第一冊(cè)以“鐵棒錘”收錄，是甘、青、寧、藏等地應(yīng)用較廣的一種民間草藥，具有活血祛瘀、祛風(fēng)濕、止痛等作用[2]。近年來，隨著鐵棒錘藥用范圍拓寬，其開發(fā)利用備受關(guān)注[3-5]。長(zhǎng)期以來一直以野生資源入藥，隨著市場(chǎng)需求的增加，人工馴化栽培已顯得日益迫切，其種子的真?zhèn)斡葹橹匾苯雨P(guān)系到藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣，為保證藥材質(zhì)量，研究一套適合其種子鑒別的方法，對(duì)鐵棒錘種質(zhì)資源的保護(hù)、評(píng)價(jià)、種子鑒定、育種以及鐵棒錘規(guī)范化種植具有重要意義[6]。

性狀鑒定是中藥鑒定的基礎(chǔ)，是一種最簡(jiǎn)單、最直觀的鑒定方法[7]，是評(píng)價(jià)中藥品質(zhì)的特色方法之一，具有簡(jiǎn)單、迅速、易行等特點(diǎn)。中藥組織形態(tài)和粉末形態(tài)具有生物學(xué)穩(wěn)定的特性，富有規(guī)律性和專屬性，其組織構(gòu)造和細(xì)胞中的代謝產(chǎn)物等與質(zhì)量密切相關(guān)，顯微鑒定在某種程度上也反映了中藥的內(nèi)在質(zhì)量[8]，半顯微性狀鑒定法[9]是一種介于性狀和顯微鑒別之間的鑒別方法，通過借鑒掃描儀、體視顯微鏡等儀器觀察中藥材細(xì)微的外觀性狀以達(dá)到鑒別的目的，在中藥真?zhèn)舞b定方面發(fā)揮了重要作用。

目前，有關(guān)鐵棒錘種子的研究主要集中在化學(xué)成分及品質(zhì)方面[10-11]，但關(guān)于不同基源鐵棒錘種子鑒別方面的研究尚未見報(bào)道。故本試驗(yàn)以不同基源鐵棒錘種子為研究對(duì)象，通過性狀、顯微、半顯微性狀鑒別，研究出一套適合其種子鑒別的方法，為鐵棒錘種質(zhì)資源的保護(hù)、評(píng)價(jià)、種子鑒定、育種以及鐵棒錘規(guī)范化種植提供理論依據(jù)。

1 儀器材料與試劑

1.1 儀 器

冷凍切片機(jī)(德國(guó)產(chǎn)Leica-CM 1950 型)；一次性刀片(日本產(chǎn)Feather)；尼康80 i顯微成像系統(tǒng)(日本產(chǎn))；掃描電鏡(阿美特克產(chǎn))；T式顯微鏡(日本產(chǎn)SMZ 800)；鑷子(金卡思官方旗艦店)；解剖針(廊坊市智航科教儀器有限公司)、游標(biāo)卡尺(桂林廣陸數(shù)字測(cè)控股份有限公司)。

1.2 試 劑

OCT包埋劑(美國(guó)制造，批號(hào) FEB-2017)、文化膠水(北京雪奧文化用品制造有限責(zé)任公司，批號(hào)1065)、載玻片及蓋玻片(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司)、水合氯醛(天津市大茂化學(xué)試劑廠2015120)、丙三醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠2014920)、甘油(天津市大茂化學(xué)試劑廠2015203)，試驗(yàn)用水合氯醛試液按《中華人民共和國(guó)藥典》2015版三部(通則8002)項(xiàng)下配制。

注：左圖為鐵棒錘種子；右圖為伏毛鐵棒錘種子。圖1 鐵棒錘種子

圖2 鐵棒錘種子解剖圖

1.3 材 料

鐵棒錘種子2016年10月收集于甘南州合作市鐵棒錘種植基地；伏毛鐵棒錘種子2016年10月收集于甘肅省臨夏回族自治州和政藥用植物園。經(jīng)杜弢教授鑒定為鐵棒錘和伏毛鐵棒錘種子。

2 方 法

2.1 性狀鑒定

觀察鐵棒錘種子形狀、表面特征及顏色、質(zhì)地、斷面及氣味，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量其種子大小。

2.2 顯微鑒定

2.2.1 組織鑒定[12]

1) 前處理：挑選飽滿的不同基源的鐵棒錘種子于培養(yǎng)皿中，用蒸餾水浸泡1～7 d，備用。

2) 固定樣品：設(shè)定冷凍切片機(jī)溫度-20 ℃，刀片固定在切片機(jī)的刀槽上，將試驗(yàn)用的毛筆、鑷子、托盤放入冷凍切片機(jī)內(nèi)一起降溫。待溫度降到-18 ℃以下時(shí)，用毛筆刷去冷臺(tái)上的薄霜。于托盤上滴加OCT或高粘度文化膠水，并用鑷子挑取飽滿種子均勻地包埋于OCT或高粘度文化膠水中。置于冷臺(tái)上，迅速冷凍2～3 h使種子牢固地黏附于托盤上，即可。

3) 切片：將托盤置于冷臺(tái)固定槽上，旋轉(zhuǎn)切片厚度調(diào)為8μm，搖動(dòng)旋轉(zhuǎn)手輪進(jìn)行切片。

4) 展片：用毛筆刷將切片移到載玻片上，或?qū)⑤d玻片直接以合適的位置靠近刀片。由于溫差作用，切片自動(dòng)黏附在載玻片上。取出載玻片，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

5) 觀察、拍照：使用尼康80 i顯微成像系統(tǒng)觀察并拍照。

2.2.2粉末鑒定

取鐵棒錘和伏毛鐵棒錘種子于研缽中研碎后過50目篩。取粉末少許，置潔凈的載玻片上，滴加1～2滴水合氯醛加熱透化后裝片，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.3 半顯微性狀鑒定

將不同基源的鐵棒錘種子除去外種皮，用蒸餾水浸泡變軟后用濾紙吸干表面水分，固定在雙面膠上，置體視顯微鏡及掃描電鏡中觀察并拍照。

3 結(jié)果與分析

3.1 鐵棒錘和伏毛鐵棒錘種子性狀鑒定

由圖1可知，2種不同基源的鐵棒錘種子形狀相似，呈倒卵狀三棱形。鐵棒錘種子長(zhǎng)3～4 mm，寬2～3 mm，厚1～2 mm；表面黑色或黑棕色，伏毛鐵棒錘種子長(zhǎng)2.1～2.9 mm，寬1.3～2.2 mm，厚1.1～1.8 mm。表面黑褐色，二者均具3條翅狀縱棱，外種皮薄而脆，較易破碎，內(nèi)種皮表面顏色較淺，呈黃棕色或淡棕色，具梯狀紋理。質(zhì)脆易碎，除去種皮，種仁類白色(圖2所示)。氣微，味苦。二者種子性狀相比，鐵棒錘種子較伏毛鐵棒錘種子大，表面顏色深。

3.2 鐵棒錘和伏毛鐵棒錘種子組織切片鑒定

由圖3和圖4可知，鐵棒錘和伏毛鐵棒錘種子組織結(jié)構(gòu)相似，均由外種皮、內(nèi)種皮、胚乳和胚4部分組成。橫切面：外種皮為一列長(zhǎng)方形棕黃色厚壁細(xì)胞，內(nèi)種皮細(xì)胞為一列長(zhǎng)方形細(xì)胞，切向延長(zhǎng)，壁較薄，細(xì)胞內(nèi)具梯狀紋理，作縱向排列，相鄰細(xì)胞間有間隙；胚乳細(xì)胞多層，呈多角形作徑向延長(zhǎng)排列，內(nèi)含糊粉粒；胚位于中央，多為類圓形、半圓形、鉤形，外層細(xì)胞呈近長(zhǎng)方形切向排列，靠近里面呈近圓形作徑向排列(如圖3 A和圖4 C所示)?？v切面：種皮為一列長(zhǎng)方形棕黃色厚壁細(xì)胞，內(nèi)種皮細(xì)胞為一列長(zhǎng)方形細(xì)胞，徑向延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)具梯狀紋理，作切向排列；胚乳多層，呈多角形或近長(zhǎng)方形作切向延長(zhǎng)排列；胚位于下方，外部細(xì)胞呈近長(zhǎng)方形，內(nèi)部細(xì)胞呈類圓形作徑向排列(如圖3 B和圖4 D所示)。

圖3 鐵棒錘種子的橫(縱)切組織切片圖

圖4 伏毛鐵棒錘種子的橫(縱)切組織切片圖

圖5 鐵棒錘種子粉末圖

圖6 伏毛鐵棒錘種子粉末圖

3.3 鐵棒錘和伏毛鐵棒錘種子粉末鑒定

鐵棒錘種子粉末呈灰黑色，伏毛鐵棒錘種子粉末呈灰褐色或黃褐色，二者粉末特征均包括外種皮、內(nèi)種皮、胚乳、糊粉粒4種細(xì)胞(見圖5、圖6)。外種皮細(xì)胞黃褐色或灰黃色，呈近長(zhǎng)方形，壁厚；內(nèi)種皮細(xì)胞棕黃色，呈多角形，具梯狀紋理，徑向壁呈連珠狀增厚；胚乳細(xì)胞多角形，內(nèi)含團(tuán)塊狀的糊粉粒。二者種子粉末相比較，鐵棒錘種子外種皮細(xì)胞較伏毛鐵棒錘狹長(zhǎng)。

3.4 鐵棒錘和伏毛鐵棒錘種子半顯微性狀鑒定

由圖7可知，不同基源鐵棒錘種子外種皮細(xì)形狀胞相，呈長(zhǎng)方形，壁較厚，作徑向排列，但鐵棒錘外種皮細(xì)胞較伏毛鐵棒錘狹長(zhǎng)，且表面顏色較深；二者內(nèi)種皮細(xì)胞表面微觀特征相似，呈多角形，具梯狀紋理。

4 討論與分析

4.1 種子浸泡時(shí)間對(duì)切片效果的影響

為得到適宜的浸泡種子時(shí)間，冷臺(tái)溫度為-20 ℃條件下，觀察不同浸泡時(shí)間(1～7 d)對(duì)其切片的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)冷臺(tái)溫度為-20 ℃時(shí)，浸泡不同時(shí)間，2種鐵棒錘種子組織切片效果不同，鐵棒錘種子浸泡2～4 d，切片完整，細(xì)胞形態(tài)清晰、效果較好；而伏毛鐵棒錘種子浸泡2～5 d時(shí)，切片效果較好。其原因可能是伏毛鐵棒錘種子較鐵棒錘飽滿，需要軟化時(shí)間長(zhǎng)。

圖7 不同基源鐵棒錘種子表面微觀特征圖

4.2 種子冷凍時(shí)間對(duì)切片效果的影響

冷臺(tái)溫度為-20 ℃條件下，考察冷凍時(shí)間(1～6 h)對(duì)組織切片的影響。結(jié)果表明，冷凍2～3 h切片效果較好。冷凍時(shí)間為0.5～1 h，因冷凍時(shí)間較短，包埋劑不夠堅(jiān)硬，切片時(shí)易產(chǎn)生刮片，影響成片；冷凍時(shí)間為4～6 h，因冷凍時(shí)間太長(zhǎng)，產(chǎn)生太多冰晶，導(dǎo)致細(xì)胞較脆，容易破損，切片時(shí)產(chǎn)生空洞進(jìn)而造成胚丟失，影響切片的完整性。故鐵棒錘種子最佳冷凍時(shí)間為2～3 h。

4.3 切片厚度對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

將切片厚度從14μm不斷降低調(diào)整到7μm，觀察其切片效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)切片厚度調(diào)整為10μm 以上時(shí)，由于切片太厚，各組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)不清晰；切片厚度調(diào)整為7μm 時(shí)，由于太薄，導(dǎo)致細(xì)胞破裂，切片中各組織結(jié)構(gòu)不完整；切片厚度調(diào)整為8μm 時(shí)，鏡下觀察，其組織結(jié)構(gòu)能較完整地呈現(xiàn)，細(xì)胞形態(tài)清晰、無空泡、空網(wǎng)狀及冰晶的形成。

4.4 包埋劑對(duì)切片效果的影響

實(shí)驗(yàn)分別用粘性較大的文化膠水和粘性較小的OCT做包埋劑，考察其對(duì)切片效果的影響。結(jié)果表明，鐵棒錘種子適宜用文化膠水做包埋劑，而伏毛鐵棒錘種子適宜用OCT做包埋劑。其原因可能是鐵棒錘種子較大而干癟，種皮皺縮，用OCT做包埋劑時(shí)，由于粘性較小，各組織粘結(jié)不緊密，有空洞易導(dǎo)致胚脫落，切片不完整；而伏毛鐵棒錘種子小且飽滿，2種膠水均可作為包埋劑。

4.5 不同基源鐵棒錘種子性狀、顯微區(qū)別

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)2種不同基源鐵棒錘種子性狀、顯微、半顯微性狀比較發(fā)現(xiàn)：不同基源鐵棒錘種子形狀相似，但大小、顏色有明顯差別；二者具相似的組織結(jié)構(gòu)特征；二者粉末相比較：鐵棒錘種子外種皮細(xì)胞較伏毛鐵棒錘狹長(zhǎng)，其結(jié)果與電鏡掃描和體視顯微鏡觀察結(jié)果相一致。

綜上所述，不同基源鐵棒錘種子在性狀、顯微和微觀特征方面有區(qū)別。本研究結(jié)果可為鐵棒錘種子的鑒定提供有效的技術(shù)方法。

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