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(數字本草中醫(yī)藥檢測有限公司， 河北 保定 071200)

瓜蔞為葫蘆科栝樓屬多年生攀援藤草本植物的果實，植物整株多處部位可入藥，《中華人民共和國藥典2015年版四部(9107通則)》規(guī)定，果實皮入藥為瓜蔞皮，根入藥為天花粉，種子入藥為瓜蔞子。其中瓜蔞子富含油脂、甾醇類、蛋白質等成分，具有潤肺化痰，滑腸通便之功效[1]和改善心血管疾病等保健功效[2]，開發(fā)潛力巨大，具有廣闊的市場前景。目前瓜蔞的繁殖方式分為有性繁殖和無性繁殖2種，種植區(qū)多采用無性分根繁殖[3]，然而無性繁殖方式的繁殖系數低，且種質易退化[4]，導致所產的瓜蔞、瓜蔞皮、天花粉等藥材質量難以保障，以種子作為栽培材料的有性繁殖方式則無此缺點。因此，開展瓜蔞種子質量標準研究不僅有利于生產，對天花粉、瓜蔞子等藥材的質量控制也具有重要意義。

目前瓜蔞在全國均有分布，尤以河北安國一帶種植歷史悠久，種植面積廣泛，故本研究以河北安國所產瓜蔞種子為重點，同時包括四川、江蘇、河南等地所產瓜蔞種子。目前關于瓜蔞種子的研究主要集中在萌發(fā)特性[5]及成分分析[6]2個方面，尚未發(fā)現有關瓜蔞種子質量標準研究的報道。本研究先采用DNA條形碼技術首先對收集的種子進行真實性鑒定，然后對12批種子凈度、水分、生活力、發(fā)芽率等指標進行測定并分析，初步制定了瓜蔞種子質量標準，為進一步制定瓜蔞種子檢驗及質量分級地方標準或國家標準提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本實驗包括19份實驗樣品，其中瓜蔞種子樣品12份，雙邊栝樓(TrichosanthesrosthorniiHarms)的基原植物3份，栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim.)的基原植物2份，栝樓屬近緣種湖北栝樓(Trichosant

表1 實驗樣品信息表

樣品名稱樣品編號GenBank號來 源瓜蔞種子GLZ01KY987477河北安國藥材市場瓜蔞種子GLZ02KY987478河北安國藥材市場瓜蔞種子GLZ03KY987479河北安國藥材市場瓜蔞種子GLZ04KY987480河北安國藥材市場瓜蔞種子GLZ05KY987481河北安國藥材市場瓜蔞種子GLZ06KY987482河北安國藥材市場瓜蔞種子GLZ07KY987483河北安國藥材市場瓜蔞種子GLZ08KY987484河北安國市祁州鎮(zhèn)西河村瓜蔞種子GLZ09KY987485江蘇宿遷瓜蔞種子GLZ10KY987486江蘇宿遷瓜蔞種子GLZ11KY987487河南沐陽瓜蔞種子GLZ12KY987488四川成都栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim.)TX01KY987489河南南陽桐柏縣栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim.)TX02KY987490四川成都雙邊栝樓(TrichosanthesrosthorniiHarms)SSN182-1KY987492湖北神農架雙邊栝樓(TrichosanthesrosthorniiHarms)SSN182-2KY987493湖北神農架雙邊栝樓(TrichosanthesrosthorniiHarms)SSN182-3KY987494湖北神農架湖北栝樓(TrichosantheshupehensisC.Y.chengetYueh)HBGL01KY987491湖北武漢王瓜(Trichosanthescucumeroides(Ser.)Maxim.)WG01KY987476江西贛州

heshupehensisC.Y.cheng et Yueh)和王瓜(Trichosanthescucumeroides(Ser.)Maxim.)的種子樣品各1份。用于質量標準建立的樣品編號為GLZ 01-12 ，共12批，所有樣本均進行真實性鑒定，樣品信息見表1。

1.2 種子取樣

按照《GB/T3543.2—1995 農作物種子檢驗規(guī)程》中的四分法進行操作，直至獲得測定各項指標所需的種子樣品。

1.3 試驗方法

1.3.1 瓜蔞種子真實性測定

采用DNA條形碼技術對瓜蔞種子與同屬的近緣種的種子進行真實性鑒別[7-8]。方法如下：

使用天根植物DNA提取試劑盒(DP 305)提取總DNA，再用通用引物ITS 2 2 F-3 R擴增其ITS 2序列，PCR反應體系為25μL，其中2×TaqPCR MasterMix 12.5μL，正反向引物(2.5μmol/L)各1μL，DNA模板約100 ng，其余用滅菌雙蒸水補足25μL。擴增條件見《中華人民共和國藥典2015年版四部(9107通則)》[1]。采用軟件CodonCode Aligner V 4.2.4拼接正反向峰圖，獲得ITS 2間隔區(qū)序列，并將序列提交至GenBank。

登陸GenBank的Nucleotide數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)下載栝樓及其近緣種長萼栝樓(TrichosantheslaceribracteaHayata)的ITS 2序列(HE 661336、38)；紅花栝樓(TrichosanthesrubriflosThorel ex Cayla)的ITS 2序列(HE 661372-73、HQ 829639-42)。將所有序列導入軟件MEGA 6分析比對，基于K 2 P模型和自舉檢驗法(1 000次)，構建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 瓜蔞種子凈度測定

根據瓜蔞種子的形態(tài)、色澤、大小特征，參考《國際種子檢驗規(guī)程》中對葫蘆科凈種子的相關規(guī)定[9]，除去雜質和其他植物種子，測定凈種子的比例。

1.3.3 瓜蔞種子千粒重測定

采用五百粒法進行測定：從分好的樣品中數出500粒作為1個重復，每批重復2次，稱重，測得其平均值后乘以2即為瓜蔞種子的千粒重[4]。

1.3.4 瓜蔞種子水分測定

采用高溫烘干法。每批樣品2次重復，樣品量2 g左右(精確至0.001 g)。溫度設定為140～145 ℃，烘干時間為1 h，減少重量的百分率即為瓜蔞種子水分含量。

1.3.5 瓜蔞種子生活力測定

使用TTC法測定瓜蔞種子生活力。將分好的栝樓樣品每份300～500粒，置于30 ℃的蒸餾水中預濕4 h。隨機抽取200粒，分成2組，每組100粒。對種子進行縱切，選留其中較為完整的1/2，浸入0.5%的紅四氮唑溶液中染色8 h[4]。

1.3.6 瓜蔞種子發(fā)芽率測定

采用砂床作為種子萌發(fā)基質。選擇大小均勻，直徑為0.05～0.80 mm砂粒，使用前先用蒸餾水沖洗并在140 ℃下干熱滅菌2 h。種子先在室溫浸泡24 h，然后使用40 ℃溫水浸泡4 h。之后使用剪刀或刀片小心去除瓜蔞種子尖端的種皮(劃傷的種子棄去不用)，使胚充分暴露。將處理好的種子置于砂質培養(yǎng)基中，上層覆蓋約5 mm的沙粒，并用噴壺澆水，使其含水量在砂床飽和含水量的80%。將3 d內無新的種子萌發(fā)的時間作為實驗終點[5]。

圖1 瓜蔞種子及其近緣種的系統(tǒng)聚類樹

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行整理和分析。方差分析采用Duncan法。

2 結果與分析

2.1 瓜蔞種子真實性測定

基于建樹分析的系統(tǒng)聚類分析是DNA 條形碼鑒別方法中較為直觀地反映物種水平分辨效果的方法，能有效地為不同類群物種鑒定提供依據。如圖1所示，(T.kirilowii)與雙邊栝樓(T.rosthornii)的序列聚為一支，說明二者的親緣關系較近；栝樓(T.kirilowii)與雙邊栝樓(T.rosthornii)能與其同屬的混偽品聚為不同的分支，說明栝樓(T.kirilowii)與雙邊栝樓(T.rosthornii)能與同屬近緣種王瓜等明顯的區(qū)分開，表明基于ITS 2序列的DNA條形碼技術能夠準確鑒定瓜蔞種子與其近緣種。

2.2 瓜蔞種子凈度測定

凈度是描述正常種子的重量占供試種子重量的參數，凈度的高低主要影響機播過程中的種子出苗率，凈度低時會造成田間缺苗斷條，從而影響產量[10]。結果表明，種子重量增失不足初始重量的5%，凈度分析有效。12批瓜蔞種子凈度很高，均在96%以上，平均值為97.31，95%的置信區(qū)間的上下限分別為97.67%和96.96%，見表2和表5。

2.3 瓜蔞種子千粒重測定

千粒重是以克為單位表示每千粒種子重量的指標。它體現著種子大小和飽滿程度，是檢驗種子質量和作物考種的重要內容，同時對預測田間產量具有重要意義[11]。本研究測定12批瓜蔞種子中，以四川成都千粒重最大，為223.85 g，與其他處理相比均達到極顯著差異；河南沐陽的最小，為123.75 g，僅占前者的55.28%；河北安國瓜蔞種子千粒重在兩者之間，且各批次間變化幅度較大。12批瓜蔞種子千粒重平均值為181.60，95%的置信區(qū)間的上下限分別為166.44 g和195.37 g，與方差分析中B水平的結果(179.33～193.60 g)較為接近，詳見表3和表5。因此，瓜蔞種子千粒重的質量指標可定為≥180 g，在此標準下，12批瓜蔞種子千粒重的合格率為75%。

表2 瓜蔞種子凈度

編號初始重量(g)凈種子(g)雜質(g)破損粒(g)增失重(g)凈度(%)GLZ01249.63243.542.833.150.1197.60GLZ02234.54227.203.064.130.1596.87GLZ03252.47243.105.983.320.0796.93GLZ04251.99245.275.411.260.0597.35GLZ05252.72247.431.763.500.0397.92GLZ06254.37248.363.262.550.2097.71GLZ07248.28244.422.531.300.0398.46GLZ08255.23247.974.172.780.3197.27GLZ09245.35235.924.564.720.1596.22GLZ10260.84254.464.561.720.1097.59GLZ11258.87251.815.241.750.0797.30GLZ12246.33237.663.425.110.1496.54

2.4 瓜蔞種子水分含量測定

水分是用于表達種子干燥程度的指標。水分高低主要受環(huán)境和人為因素影響，可以通過調整加工方式來改變。在不損害種子活力的前提下，水分含量越低，種子的儲藏性能和壽命越長，因此種子質量標準中往往限制最高值[12]。結果顯示，編號為GLZ 06的瓜蔞種子含水量最低，為5.38%，而編號為GLZ 08的瓜蔞種子水分含量最高，為8.62%，不同批次樣品間水分差異顯著。12批瓜蔞種子水分平均值為6.64%，95%的置信區(qū)間的上下限分別為6.21%、7.09%，與方差分析中B水平的結果(6.77%～6.97%)較為接近，詳見表4和表5。因此，瓜蔞種子水分的質量指標可定為不超過7.0%。在此標準下，12批瓜蔞種子水分的合格率為83%。

表3 瓜蔞種子千粒重

編號千粒重(g)2次重復差數差數與平均數之比(%)GLZ01193.60Bb2.782.87GLZ02179.33Bc2.292.55GLZ03144.58Cd3.524.87GLZ04186.84Bbc4.364.67GLZ05181.98Bbc3.323.65GLZ06191.10Bbc3.303.45GLZ07183.73Bbc3.553.86GLZ08187.59Bbc3.814.06GLZ09185.57Bbc2.632.83GLZ10180.15Bc4.494.98GLZ11124.20De2.123.41GLZ12228.05Aa2.352.06

注：同列大寫字母表示p<0.01水平下的差異顯著性，同列小寫字母表示p<0.05水平下的差異顯著性。下同。

表4 瓜蔞種子水分、生活力、發(fā)芽率檢測

編號水分(%)生活力(%)發(fā)芽率(%)GLZ016.77CDd88Bb41BbGLZ026.38FGf89Bb31BCcGLZ036.98Cc87Bb33BCbcGLZ045.99Hg88Bb35BbcGLZ056.15GHg95Aa65AaGLZ065.38Ih89Bb34BbcGLZ076.97Cc57Cc17DdGLZ088.62Aa95Aa60AaGLZ096.09Hg60Cc21CDdGLZ106.64DEde39Dd16DdGLZ116.47Fef59Cc21CDdGLZ127.31Bb87Bb38Bbc

2.5 瓜蔞種子生活力測定

生活力是表示種子發(fā)芽潛在能力和種胚所具有的生命力的重要指標，尤其對于重度休眠的種子，生活力數據可以代替發(fā)芽率使用[13]，研究發(fā)現不同來源瓜蔞種子生活力差異達到極顯著水平，其中編號為GLZ 05的瓜蔞種子生活力最高，達到95.3%，編號為GLZ 10的江蘇宿遷種子生活力最低，僅為48.3%，各批次的瓜蔞種子生活力差異顯著。12批瓜蔞種子生活力平均值為77.67%，95%的置信區(qū)間的上下限分別為67.72%、87.28%，與方差分析中B水平的結果(68%～87%)較為接近，詳見表4和表5。因此，瓜蔞種子生活力的質量指標可定為不低于85%。在此標準下，12批瓜蔞種子生活力的合格率為66.7%。

表5 瓜蔞子各質量指標均值統(tǒng)計結果

質量指標均值自助法偏差標準誤差95%置信區(qū)間下限上限凈度97.310.00530.173596.9697.67千粒重181.60-0.21057.2822166.44195.37水分6.64-0.00340.22546.217.09生活力77.670.49674.941967.7287.28發(fā)芽率34.33-0.00514.255126.5943.33除非特別注明,自助法結果基于1000個樣本量

2.6 瓜蔞種子發(fā)芽率測定

發(fā)芽率是衡量種子是否具有生活力的直接指標，并直接影響種子田間出苗率，對確定種子價格，種子等級劃分具有重要意義。研究結果顯示，不同批次間種子發(fā)芽率差異達到極顯著水平，同時由于瓜蔞種子的休眠特性[14]，整體發(fā)芽率較低，最高的也僅為65%，最低不足25%。12批瓜蔞種子發(fā)芽率平均值為34.33%，95%的置信區(qū)間的上下限分別為26.59%、43.33%，與方差分析中B水平的結果(31%～41%)相近，詳見表4和表5。因此，瓜蔞種子發(fā)芽率的質量指標可定為不低于30%。在此標準下，12批瓜蔞種子發(fā)芽率的合格率為66.7%。

3 討論與結論

種子作為中藥材生產的物質基礎，其質量好壞直接影響到藥材的安全性、穩(wěn)定性和有效性，進而影響整個中醫(yī)藥產業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展[15]，因此建立及推廣藥材種子標準，能有效抑制藥材種子市場亂象，促進中藥材產業(yè)規(guī)范化和標準化[16]。與農作物相比，中藥材種子質量的研究嚴重滯后，僅人參具有國家標準，黃芪、板藍根、丹參等少數品種建立了地方標準，但大部分中藥材種子既沒有強制性的國家標準，也缺乏針對性的地方、行業(yè)標準，導致中藥材種子市場種源混亂，新舊種摻雜等亂象[17]。其中，瓜蔞種子質量在種植領域尚未發(fā)現國家或地方標準，也未發(fā)現相關文獻報道。

瓜蔞種子常見混偽品有湖北栝樓的種子、王瓜的種子等，其中湖北栝樓廣泛分布于湖北、湖南、四川、山東等地，其種子外觀與正品瓜蔞種子相似難以區(qū)分，但其根部入藥會引起患者嘔吐、惡心等不良反應，因此準確區(qū)分瓜蔞種子及其混偽品對臨床用藥安全具有重要意義[20]。本研究通過DNA條形碼技術和系統(tǒng)聚類樹的結合，可將瓜蔞種子、湖北栝樓種子、王瓜種子準確區(qū)分開來，且該技術要求低、通用性高，同時又能夠避免經驗鑒別主觀因素的影響，因此建議采用DNA條形碼技術對中藥材種子的真實性進行鑒定，確保中藥材種源真實可靠，保障用藥安全[8]。

常規(guī)的種子質量檢測包括種子凈度、千粒重、水分、生活力、發(fā)芽率、發(fā)芽指數、發(fā)芽勢等指標，因本實驗采用了砂質培養(yǎng)基未能對發(fā)芽指數和發(fā)芽勢指標進行檢測。該培養(yǎng)基可以在一定程度上減緩霉菌傳播速度，降低發(fā)霉對種子發(fā)芽率的影響[18-19]，提高種子的發(fā)芽率。

千粒重反映種子貯藏物質的多少，種子成熟度和幼苗長勢，對種子質量評價具有重要意義[21]；水分主要受人為及客觀因素影響而非種子生物學特性決定，但水分的高低影響種子貯藏和壽命，應作為質量評價指標；生活力體現種子萌發(fā)潛力，并可以作為種子發(fā)芽水平的間接評價指標，尤其對于具有休眠特性的種子，通過測定生活力可以快速預知種子的價值[22]；發(fā)芽率可以較為直接的反映種子在田間的出苗狀況，是評價種子質量最為重要的指標。因此，參考種子常規(guī)檢測項目選擇千粒重、水分、生活力、發(fā)芽率4項指標對瓜蔞種子質量進行評價。

本研究參考其他種子質量標準，統(tǒng)計不同產地和來源瓜蔞種子千粒重、水分、生活力，發(fā)芽率4項指標，結合均值置信區(qū)間和方差分析結果并以該方差水平下最小值所接近的整數為依據，提出瓜蔞種子質量標準：千粒重≥180 g，含水量≤7.0%，生活力≥85%，發(fā)芽率≥30%。該標準能有效排除不合格種子，保證用于生產的種子質量。

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