(秦皇島市海港區(qū)農(nóng)業(yè)局， 河北 秦皇島 066000)

糯玉米，即粘玉米，發(fā)源地為中國，是由普通玉米第9號染色體Wx顯性基因突變?yōu)閣x隱性基因而形成的一類特殊玉米類型[1]。糯玉米籽粒中含有糖分、蛋白質(zhì)、多種氨基酸及礦質(zhì)元素，粘滯性和適口性較好，深受人們的關(guān)注和喜愛[2]。我國具有得天獨厚的糯玉米種質(zhì)資源優(yōu)勢，各科研院所、企事業(yè)單位也十分重視糯玉米新品種的選育工作，但是由于缺乏快速的育種技術(shù)手段、異地鑒定方法，造成常規(guī)育種進(jìn)程止步不前，難以有較大的突破[3-4]。一般而言，我國糯玉米育種家多采用系譜法、回交轉(zhuǎn)育法進(jìn)行糯玉米新品種的選育，也育成了如京科糯2000等廣泛推崇的新品種[5]，但常規(guī)育種法存在育種周期長、流程繁瑣、育種成本高等諸多問題，不易滿足當(dāng)前實際商業(yè)化育種的需求。雜交誘導(dǎo)玉米單倍體技術(shù)可大大縮短自交系的選育時間，僅需2代即可獲得純系?，F(xiàn)如今，在普通玉米育種中，單倍體技術(shù)已經(jīng)逐步取代常規(guī)育種技術(shù)而成為主流育種技術(shù)，然而應(yīng)用于糯玉米育種尚缺乏有效實踐。

單倍體加倍DH(Doubled Haploid)是玉米育種的關(guān)鍵步驟之一[6-8]。一般而言，各育種單位多采用以秋水仙素為主的化學(xué)加倍方法進(jìn)行玉米單倍體的加倍。本試驗基于秋水仙素這一有效的加倍藥劑，通過比較不同加倍方法、秋水仙素濃度、加倍溫度和加倍時間下的糯玉米單倍體加倍效果，為糯玉米DH育種提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材 料

2015年冬，在海南南繁基地，以糯玉米雜交種西星糯1號、萊農(nóng)糯6號、萬糯2000、豐糯1號、鄭黃糯2號作為誘導(dǎo)基礎(chǔ)材料，以外引系RH 20為父本，進(jìn)行雜交誘導(dǎo)，收獲籽粒晾干后在雜交當(dāng)代果穗上根據(jù)籽粒R-nj標(biāo)記法挑選出糯玉米單倍體籽粒為供試材料。

1.2 方 法

1.2.1 同一秋水仙素濃度不同化學(xué)加倍方法的比較

用0.8 mg/mL的秋水仙素+2%DMSO助滲劑對基于5份糯玉米雜交種誘導(dǎo)出來的糯玉米單倍體進(jìn)行化學(xué)加倍處理，加倍方式分別為：浸芽法、浸種法、浸根法，環(huán)境溫度為25 ℃，處理時間為10 h。種植單倍體，授粉后調(diào)查加倍結(jié)果，統(tǒng)計試驗數(shù)據(jù)。

1.2.2 不同濃度和時間處理下的浸根法加倍比較

以源于糯玉米雜交種西星糯1號獲得的糯玉米單倍體為供試材料，當(dāng)環(huán)境溫度為22 ℃時，采用浸根法處理誘導(dǎo)的單倍體，設(shè)置不同秋水仙素濃度，分別為0.3，0.5，0.7，0.9，1.1 mg/mL，設(shè)置6，10，12 h等3種加倍時間，種植鑒定方法同上。

1.3 統(tǒng)計分析

采用軟件Excel 2013、DPS 7.05進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 同一秋水仙素濃度不同化學(xué)加倍方法的比較

將5種化學(xué)加倍方法加倍處理5種糯玉米單倍體的統(tǒng)計結(jié)果列于表1。由表1可知，滴心葉法加倍率均值最高，達(dá)11.14%；植株注射法加倍率最低，僅為1.62%。利用無重復(fù)雙因素方差分析法進(jìn)行加倍效果的差異性比較，結(jié)果列于表2。由表2可知，加倍方法間達(dá)到極顯著水平，品種間未達(dá)到顯著水平，這說明加倍方法是影響糯玉米單倍體加倍的重要因素。由表3可知，滴心葉法、浸根、浸種、浸芽的加倍效果明顯，加倍率均高于3%，而植株注射法加倍率較低，低于2%。通過差異顯著性比較可知，上述4種加倍方法極顯著高于植株滴心葉法。5種加倍方法中以滴心葉法最好，加倍效率高于10%，說明此方法較適合糯玉米單倍體的加倍，值得通過擴(kuò)大種質(zhì)群體進(jìn)一步實踐。

表1 5種糯玉米單倍體用不同方法處理的加倍率

方法品種名稱西星糯1號萊農(nóng)糯6號萬糯2000豐糯1號鄭黃糯2號浸種4.325.723.322.127.62滴心葉11.728.6212.0212.5210.82浸根5.926.427.226.825.62浸芽3.422.924.625.423.32植株注射1.322.321.420.622.42

表2 方差分析

變異來源平方和自由度均方F值區(qū)組間1.3240.470.26處理間330.36466.2236.11**誤差37.54161.78總變異369.2224

注：“**”表示差異達(dá)到極顯著水平。下同。

表3 5種糯玉米單倍體用不同方法處理的加倍率差異顯著性比較

方法平均加倍率(%)5%顯著水平1%極顯著水平滴心葉法11.14aA浸根法6.40bB浸種法4.62bcBC浸芽法3.94cCD植株注射法1.62dD

2.2 西星糯1號在不同濃度、不同時間下的加倍效果

當(dāng)環(huán)境溫度為22 ℃時，將源于糯玉米雜交種西星糯1號的單倍體在秋水仙素不同濃度、不同加倍時間處理下的滴心葉法加倍效果列于表4。由表4可知，同一處理時間下，在0.3～0.7 mg/mL濃度范圍內(nèi)，均表現(xiàn)出隨著秋水仙素濃度的增加，加倍效果越來越明顯的規(guī)律，但高于0.7 mg/mL濃度后，加倍率反而降低，出現(xiàn)加倍抑制現(xiàn)象。這可能是由于隨著秋水仙素濃度的增加導(dǎo)致單倍體種子內(nèi)酶活性下降，進(jìn)而出現(xiàn)加倍率降低。由方差分析結(jié)果(表5)可知，不同秋水仙素濃度間、加倍時間之間均達(dá)到極顯著差異，說明秋水仙素濃度、加倍時間是影響糯玉米單倍體加倍效果的關(guān)鍵因素。由表6可知，當(dāng)秋水仙素濃度為0.7 mg/mL時，糯玉米單倍體加倍率均值高達(dá)11.00%，極顯著高于其它濃度。當(dāng)秋水仙素濃度為0.5 mg/mL和0.9 mg/mL時，加倍率均值差異不顯著，加倍率分別為8.60%和6.27%。當(dāng)秋水仙素濃度為0.3 mg/mL和1.1 mg/mL時，單倍體加倍率均值均表現(xiàn)最低，僅為5.30%和3.27%。由表7可知，加倍時間為10 h時，糯玉米單倍體加倍率均值為7.70%，極顯著高于6 h和12 h的糯玉米單倍體加倍效果，說明加倍時間10 h是糯玉米單倍體加倍的最佳處理時間。

表4 西星糯1號在不同濃度不同時間下的加倍率

濃度(mg/mL)6h10h12h0.33.75.86.40.56.58.510.80.79.712.610.70.94.67.56.71.14.72.62.5

表5 方差分析

變異來源平方和自由度均方F值濃度120.88430.2232.36**時間18.3129.179.77**誤差7.2780.87總變異146.4614

表6 西星糯1號在不同濃度下的加倍率差異顯著性比較

濃度(mg/mL)平均加倍率(%)5%顯著水平1%極顯著水平0.711.00aA0.58.60bB0.96.27cC0.35.30cCD1.13.27dD

表7 西星糯1號在不同處理時間下的加倍率差異顯著性比較

時間(h)平均加倍率(%)5%顯著水平1%極顯著水平107.70aA125.60bB65.16bB

3 結(jié)論與討論

目前，生產(chǎn)上推廣的糯玉米雜交種類型較為單一，抗逆性差，迫切需要通過新技術(shù)、新手段、新方法選育出優(yōu)質(zhì)、粒色佳、果穗均勻、口感更加香甜的糯玉米新品種來滿足多元化的市場需求。基于普通玉米培育新品種的DH育種技術(shù)正逐步應(yīng)用于糯玉米育種中，日益受到各科研單位、企業(yè)公司的重視[11]。

有效的糯玉米單倍體加倍技術(shù)體系的建立是解決糯玉米單倍體加倍率低的直接措施。才卓等研究表明，不同秋水仙素濃度、處理時間、加倍方法均是影響單倍體加倍效果的重要因素[8]。本研究結(jié)果表明，糯玉米單倍體加倍方法間存在極顯著差異，說明加倍方式是影響糯玉米單倍體加倍的重要因素，這與前人的