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(1.洛陽理工學院環(huán)境工程與化學系， 河南 洛陽 471023； 2.河南科技大學農(nóng)學院， 河南 洛陽 471003)

種子老化是種子貯藏過程中普遍存在的一種現(xiàn)象，不但影響種子的萌發(fā)和幼苗生長及后期種子的產(chǎn)量與品質(zhì)，而且對種質(zhì)資源的保存、開發(fā)和利用等都產(chǎn)生嚴重的影響[1]。到目前為止，國內(nèi)外關于許多種作物種子老化及劣變的機理過程研究已經(jīng)進行了很多，但種子老化的具體內(nèi)部機理還存在很多疑問，對種子老化過程中的生理生化變化還有待進一步的研究。目前，一般認為膜脂超氧化作用及自由基增加是引起或加劇種子老化劣變的重要原因[2]，但其具體的老化過程以及其中的生理生化變化還不清楚。因此，進行人工模擬種子老化的相關研究，揭示種子老化機理并進一步找出相關減緩種子老化速率的應對策略，對于種質(zhì)資源保存和環(huán)境保護以及作物的繁殖生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實意義。本試驗通過人工加速老化的方法對棉花品種進行研究，為提升種子安全貯藏，解析種子衰老機理，提高種子科學利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材 料

棉花種子(魯棉10號)、無水乙醇、10%三氯乙酸(TCA)、0.6%硫代巴比妥酸(TBA)、pH=7.8的磷酸緩沖液、氮藍四唑(NBT)溶液、石英砂等。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子老化

隨機揀選大小相同，健康的種子900粒進行試驗，將選好的平均分成18份，將分好的種子放入人工老化處理箱(LH-80型)中，設置溫度50 ℃，相對濕度100%進行模擬老化處理，處理時間分別為0(ck)，2，4，6，8，12 d，3次重復。老化處理結(jié)束后，將種子取出，實驗室自然條件下晾干備用。

1.2.2 發(fā)芽實驗

采用沙培法進行標準發(fā)芽試驗[3]。培養(yǎng)4 d后，統(tǒng)計不同處理時間種子的發(fā)芽數(shù)(以芽長超過種子1/2為發(fā)芽標準)進行統(tǒng)計，記錄數(shù)據(jù)。發(fā)芽率(%)=發(fā)芽總數(shù)/供試種子總數(shù)×100%；發(fā)芽勢(%)=4 d內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%；發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)，式中：Gt為在時間t內(nèi)的發(fā)芽個數(shù)；Dt為發(fā)芽天數(shù)。

1.2.3 POD、SOD活性、MDA含量的測定

選取發(fā)芽第12天的棉花幼苗為材料，取其下胚軸用于測定POD、SOD的活性[4]和MDA的含量[5]。

1.2.4 相對電導率的測定

本試驗采用浸泡法測定棉花葉片的電導率。每組處理取幼苗材料0.5 g，用蒸餾水沖洗3次洗凈，用吸水紙將葉片表面的水滴吸干，將葉片處理適宜的形狀，分別放置于50 mL的三角瓶中，密封后放置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中浸泡1 d，對浸泡后的溶液用電導率分析儀進行電導率測定，而后將各處理煮沸30 min，室溫下冷卻，再對煮沸后浸泡溶液進行絕對電導率測定。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

用SPSS for windows 11.5與 Excel 2007版本軟件進行單因素方差分析與作圖，計算結(jié)果以均數(shù)表示，檢驗水準α=0.05。其中，小寫字母表示5%顯著差異，大寫字母表示1%極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同老化處理時間對棉花種子發(fā)芽的影響

從表1可以看出，隨著老化處理時間的延長，棉花種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢以及發(fā)芽指數(shù)都逐漸下降。在老化試驗2 d內(nèi)種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢降低很慢，處理2 d的棉花種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢降低值僅為對照的7.66%、3.34%。從老化處理4 d開始，種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率發(fā)生顯著性下降，老化處理12 d的棉花種子發(fā)芽率僅為50%。從表1還可以看出，發(fā)芽指數(shù)對種子老化反響最敏感，從老化開始發(fā)芽指數(shù)就表現(xiàn)出在0.05水平上的顯著下降。

表1 不同老化處理時間對種子發(fā)芽指標的影響

處理天數(shù)(d)發(fā)芽率(%)發(fā)芽勢(%)發(fā)芽指數(shù)088.00aA40.67aA22.35aA280.34bAB37.33abA20.08bA474.00cB34.00bAB15.53cB669.34cBC28.67cB15.89dC862.67dC16.00dC9.27eD1250.00eD12.67dC7.53fD

注：表中小寫字母表示p<0.05水平差異顯著；大寫字母表示p<0.01水平差異顯著。

2.2 不同老化處理時間對棉花種子MDA含量的影響

種子 MDA含量的大小從一定水平上反映出細胞結(jié)構(gòu)破壞的程度。從圖1可以看出，種子幼苗中MDA含量隨老化處理時間的延長而逐漸增加。在老化處理2 d內(nèi)，種子幼苗下胚軸中MDA 含量變化很小，即老化處理2 d對種子的活力并沒有太大的影響，而2～4 d內(nèi)MDA的含量發(fā)生了顯著的變化，這與表1內(nèi)種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢急劇下降相符合，說明這段時間內(nèi)種子的活力急劇老化。老化處理4 d后，種子幼苗中丙二醛含量緩慢增加，并沒有發(fā)生顯著的變化。

圖1 不同老化處理時間對棉花種子MDA含量的影響

2.3 不同老化處理時間對棉花種子SOD、POD活性的影響

細胞中的SOD、POD活性能反映出細胞質(zhì)膜的完整性以及細胞損傷程度。由圖2和圖3可以看出，隨著老化時間的延長，種子幼苗中SOD、POD活性慢慢降低，2種酶的活性變化基本一致。從圖3還可以看出，在處理2～4 d時種子中SOD活性明顯下降，這與圖1中MDA含量的增加相符合。在老化12 d時，種子幼苗中SOD活性僅為0 d的43%。

2.4 不同老化處理時間對棉花種子相對電導率的影響

由圖4可知，隨著老化處理程度的加深，種子幼苗的相對電導率緩慢增加。在老化處理前期，老化種子的相對電導率變化較小，從老化處理開始后顯著升高，老化處理8 d和12 d的相對電導率分別是對照的1.9倍和2.1倍。經(jīng)過不同梯度差異處理后，相對電導率呈慢慢增加的趨勢。說明隨著梯度處理時間的延長，種子細胞膜的膜質(zhì)超氧化一直加強，細胞的系統(tǒng)受到的破壞逐漸加重，細胞結(jié)構(gòu)系統(tǒng)的完整性越來越差，膜的滲透性增長，造成細胞內(nèi)的物質(zhì)大量外滲，導致種子生命力下降。

圖2 不同老化處理時間對棉花種子POD活性的影響

圖3 不同老化處理時間對棉花種子SOD活性的影響

圖4 不同老化處理時間對棉花種子相對電導率的影響

3 結(jié)論與討論

種子生活力是反映種子潛在發(fā)芽率的能力，它與種子的發(fā)育、貯藏以及萌芽等生理活動密切相關，生產(chǎn)上常以發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)來測定種子的生活力。在自然條件下，種子的生活力會隨著保存時間的延伸而下降。張玲麗等在不同類型小麥品種人工老化處理后種子活力特性的研究中表明，模擬老化處理條件下植株活力的衰退先于植物生命力，表現(xiàn)為發(fā)芽速率明顯減慢，生活力降低[6]。 本研究結(jié)果表明，隨著人工老化處理程度的加深，種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)均呈下降的趨勢。這與喬燕祥等[7]在花生種子人工老化對萌發(fā)期種子活力的影響研究的結(jié)果一致。

種子老化首先起始于種子細胞結(jié)構(gòu)的破壞，結(jié)構(gòu)的破壞引起細胞的滲透性增加，表現(xiàn)為物質(zhì)和代謝滲透量的加大，其中包括游離離子、可溶性糖、各種蛋白質(zhì)等，同時還有一定量的固定的氣體物質(zhì)釋放，引起種子浸出液的相對導電率上升[8]。韓熠等關于人工老化處理對高粱種子萌發(fā)及生理生化特性的影響研究中表明，不同高粱種子MDA擁有量跟著處理時間的增加呈上升趨勢，并且與對照相比差異達顯著水平[9]。這與本研究的結(jié)果相符。孫春青等的研究表明，隨著老化處理時間的加深，甘藍種子MDA含量呈現(xiàn)先增加后逐漸下降的趨勢[10]。這與本研究的結(jié)果有些不同，這可能與老化種子的特性有關。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著老化處理時間的增加，種子幼苗中的MDA含量在老化處理前期變化緩慢，而后變化較為迅速，在老化處理后期MDA含量的變化又變?yōu)榫徛?，這種慢快慢的變化與種子的發(fā)芽指標變化相符合。

老化引起的植物細胞膜的破壞必然會涉及到細胞膜上各種酶的活力，本研究通過測定老化幼苗中SOD、POD活性發(fā)現(xiàn)，伴隨老化處理間隔的增加，SOD、POD 2種酶的活性整體上呈現(xiàn)下降的趨勢。這與羅布麻[11]和大麥[12]種子老化過程中的生理生化特性中的結(jié)果相一致。在老化處理前2種酶的功能變化很小，這可能是在時間的老化處理中，棉花種子自身具有修復一些酶活性的能力，在老化處理后期2種酶的功能都出現(xiàn)急劇下降，這可能是種子的細胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，種子自身的修復能力遠遠低于種子損傷的能力。隨著損傷的加大，SOD、POD活力迅速下降，SOD、POD 2種酶消除細胞中自由移動基的功能下降，造成細胞中游離的自由基含量增加，游離的自由基損傷細胞的膜系統(tǒng)，造成植物質(zhì)膜的完全性遭到損傷，種子的生活力下降。

植物細胞完整性的破壞致使細胞的選擇通過性降低，細胞中的水溶性物質(zhì)大量外滲，此時如果把植物組織放置在去離子水中，一段時間后去離子水的導電性將因水溶性物質(zhì)的外滲而增大。細胞完整性損傷越嚴重向外泄露物質(zhì)越厲害，電導率的上升也就越高，故可根據(jù)外液電導率的上升值來推測植物完整性的損傷大小[13]。在高粱[9]、羅布麻[11]、小麥[14]和煙草[15]等作物中均發(fā)現(xiàn)隨著老化處理的加深，浸出液的電導率都呈現(xiàn)上升的趨勢。本研究通過測定老化種子幼苗的相對電導率，發(fā)現(xiàn)棉花種子在老化過程中電導率也有上升的趨勢，但棉花種子的相對電導率上升的趨勢很慢，這可能與棉花種子具有堅硬致密的外殼，種籽富含油脂物質(zhì)有關。

種子老化過程的機理是一個多樣性的過程，它關系到種子的發(fā)芽指標和幼苗細胞膜的完整性，以及膜上酶的活性[16]。本研究通過測定種子的萌發(fā)指標、SOD、POD活性以及相對電導率對棉花種子老化的生理生化有初步的闡明，而對種子老化機理的具體過程及機制還有待從分子方面做更進一步的研究。

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