， ，

(1.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 貴陽(yáng) 550001； 2.貴州省草原監(jiān)理站， 貴陽(yáng) 550001)

白三葉(TrifoliumrepensL.)又名白車軸草、荷蘭翹搖，是多年生高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)豆科牧草，具有固氮能力強(qiáng)，適應(yīng)性廣等特點(diǎn)[1]，在中國(guó)亞熱帶及暖溫帶地區(qū)有較廣泛分布，是中國(guó)西南喀斯特地區(qū)畜牧業(yè)主推牧草之一，而貴州自然條件和生態(tài)類型多樣，蘊(yùn)藏著十分豐富的白三葉草種質(zhì)資源，是野生白三葉資源最豐富的地區(qū)之一[2]。

多樣性的研究主要從4個(gè)水平開展，即形態(tài)學(xué)水平、細(xì)胞水平、生化水平和DNA分子水平。國(guó)內(nèi)在形態(tài)水平[3-5]、細(xì)胞水平[6]、生化[7]水平上的白三葉多樣性研究已取得一定成果，但分子水平的白三葉遺傳多樣性研究正在逐步開展與深入。少數(shù)學(xué)者運(yùn)用RAPD[8]、SRAP[9]，SSR[10]、ISSR[11]分子標(biāo)記對(duì)白三葉進(jìn)行了遺傳多樣性研究，但國(guó)內(nèi)用SSR分子標(biāo)記研究和評(píng)價(jià)白三葉遺傳多樣性、形態(tài)進(jìn)化及群落穩(wěn)定性還未見報(bào)道。

表1 實(shí)驗(yàn)材料

群體 采樣地點(diǎn)緯度(N)經(jīng)度(E)海拔(m)W1 碧江區(qū)川硐鎮(zhèn)27°41'26.80″109°10'52.07″258W2 臺(tái)江縣臺(tái)供鎮(zhèn)萬(wàn)畝草場(chǎng)26°40'15.22″108°18'50.57″638W3 松桃縣大興鎮(zhèn)27°53'08.32″109°17'45.04″687W4 鳳崗縣龍泉鎮(zhèn)柏梓村27°57'44.88″107°43'02.09″731W5 臺(tái)江縣臺(tái)供鎮(zhèn)大德村26°38'34.97″108°15'06.42″750W6 臺(tái)江縣臺(tái)供鎮(zhèn)南市村26°38'51.79″108°18'06.92″755W7 德江縣煎茶鎮(zhèn)28°08'59.08″107°58'50.06″820W8 綏陽(yáng)縣27°56'51.95″107°11'28.70″868W9 冊(cè)亨縣秧壩鎮(zhèn)秧壩村壩納組24°53'14.84″105°49'19.43″971W10 黃平縣新州鎮(zhèn)涼風(fēng)坳半坡26°55'02.34″107°53'59.92″984W11 匯川區(qū)董公市鎮(zhèn)27°45'00.85″106°56'03.89986W12 金沙安底鄉(xiāng)安底村27°23'29.98″106°26'15.14″1007W13 臺(tái)江縣方召鄉(xiāng)李子村到黃毛地段26°39'25.48″108°21'57.56″1127W14 六枝特區(qū)平寨鎮(zhèn)塔山村26°14'11.7″105°26'48.1″1350W15 黔西林泉王正溝村27°00'50.97″105°50'21.49″1353W16 興仁縣真武山街道辦事處三村叉河組25°26'01.38″105°11'10.01″1355W17 望謨縣打易鎮(zhèn)毛坪村上打鬧灣組25°21'46.07″106°06'28.72″1364W18 七星關(guān)區(qū)歷陽(yáng)山27°17'54.97″105°08'18.56″1509W19 晴隆縣蓮城鎮(zhèn)五一村南山組25°49'19.21″105°12'44.78″1527W20 施秉縣城關(guān)鎮(zhèn)小河村26°49'09.73″108°20'09.39″1596W21 赫章縣媽姑村27°12'43.08″105°08'44.16″1748W22 威寧縣板底村27°22'16.71″104°18'48.90″2198

SSR(Simple Sequence Repeat)，即簡(jiǎn)單重復(fù)序列，又稱微衛(wèi)星。微衛(wèi)星DNA在真核生物的基因組中廣泛存在，SSR重復(fù)基序數(shù)目及位置的變化而顯示出較強(qiáng)的多態(tài)性[12]。同時(shí)，SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有較高的多態(tài)性、標(biāo)記位點(diǎn)覆蓋整個(gè)基因組且分布均勻、DNA樣品用量少、技術(shù)穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[13]。本研究收集貴州野生白三葉種質(zhì)材料，采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)其多樣性進(jìn)行分析與鑒定，為白三葉種質(zhì)資源的開發(fā)利用及培育優(yōu)良栽培新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2013年5—8月在貴州省范圍內(nèi)收集野生白三葉種子進(jìn)行溫室培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)試劑：DNA提取試劑盒(購(gòu)自大連寶生物公司)，26對(duì)SSR引物(由大連寶生物公司合成)。

1.2 白三葉總DNA提取

取野生白三葉新生葉片提取總DNA。用0.75%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量。

1.3 SSR-PCR擴(kuò)增體系與程序

參考牟彤[14]及張婧源[9]白三葉SSR分析體系，通過單因素梯度組合試驗(yàn)，得到優(yōu)化后最優(yōu)的白三葉20μL反應(yīng)體系：模板20 ng，10×PCR Bufer 2μL,Mg2+(25 mmol/L)2.4μL，dNTP(2.5 mmol/L)1.6μL，TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)0.1μL，上、下游引物均為0.6μL(0.1 mmol/μL)，滅菌水補(bǔ)足20μL，覆蓋礦物油。

SSR-PCR擴(kuò)增程序參見Li[15]和張婧源[9]的程序做以下優(yōu)化：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min， 72 ℃延伸1 min，重復(fù)40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，最后4 ℃保存。用6%的聚丙烯酰氨凝膠(PAGE)電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。電泳條件：電壓630 V，電泳時(shí)間依據(jù)不同引物的擴(kuò)增片段大小酌情而定。0.15% AgNO3染色10 min，1.5% NaOH 顯影，晾干后讀帶。

1.4 引物篩選

參照Z(yǔ)ietkiewicz[16]與K?lliker[17]研究，挑選出多樣性較高的26對(duì)SSR引物，由大連寶生物公司合成。從供試材料中選出質(zhì)量較高而形態(tài)性狀差異較大的W 16及W 17對(duì)26對(duì)引物進(jìn)行剔選,最終選出20對(duì)多態(tài)性好、穩(wěn)定性高、條帶清晰的引物對(duì)全部材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見表2。

1.5 數(shù)據(jù)處理

對(duì)凝膠電泳后獲得清晰穩(wěn)定的DNA擴(kuò)增條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，記在相同遷移的位置上的譜帶，有帶賦值“1”，無帶賦值“0”，建立遺傳相似矩陣。通過該矩陣，統(tǒng)計(jì)SSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物總條帶數(shù)和具有多態(tài)性的條帶數(shù)，用Excel計(jì)算多態(tài)性位點(diǎn)百分率PPB(PPB=NPB/TNB，TNB為SSR-PCR擴(kuò)增的總條帶數(shù)，NPB為具多態(tài)性的條帶數(shù))[18]、標(biāo)記指數(shù)MI(MI=NPB×PIC)[10]、引物多態(tài)性信息含量PIC(PIC=2fi(1-fi)，PICi表示引物多態(tài)性信息含量；fi表示有帶所占的頻率)。用NTSYS-PC 2.02軟件計(jì)算Dice遺傳距離GD(GD=[1-2Nij/ (Ni+Nj)],Ni是指材料i中出現(xiàn)的擴(kuò)增片段數(shù)，Nj是指材料j中出現(xiàn)的擴(kuò)增片段數(shù)，Nij指的是材料i和j共有的擴(kuò)增片段數(shù))，用以估計(jì)各白三葉種質(zhì)間的遺傳多樣性[18-19]。根據(jù)UPGMA法進(jìn)行遺傳相似性聚類分析[20]。

表2 SSR引物名稱及其序列

引物 引物序列(5'-3')引物 引物序列(5'-3')POI01AGAAAGGTGAATGATGAAATCTAATTCTTCCAATAGGGPOI14TTCAGGCTTCGTAACAACATCATTGGAGCCGCCAACTTCATPOI02TTTTCGCATTGTTTCAGACCCCCTTTCTCAACCCACATCPOI15TATACATGCCTTTGTTAAATGTGACTAATACTCGAGAAGCCTCAAGAGPOI03TGGCTATTACAACTTGGAGACGAGGCATACTTGATGATGGPOI16TGTCAGATGTCATGCATATTTCAGTTGAAGTGATTAACGAAGAAGGAGPOI04TATGCTGGTAGATAAACTTAAATGCTCTGGAGATTGATGGPOI17ACATTTGAACATGACATCACCGAATTCTACTTTGAGGGTGAGCTTTGGPOI05AAGTGTTGGACAAGGAAACTAGGTCTCTAGATCACCGGCATTGPOI18TTTTGTCTAATTGCAGAACCATGGTTTAAGTAACAGGTTGATGCGTACPOI06CAGTAAAGGAATCTGTTCAAACTAAACACCAATCAGACCGAAAPOI19ACGGGAGATAATTCATTTCTGAAGGGTCGAGAAATACAACATGCATACPOI07GTACCTGGAAATGTTGATTGAGCAGCCATGACCTCTGPOI20ACATGTCTTTGGATTTATTACAGGTCAGGGCACTATAAAATTAGTGTTPOI08AGAAAGGTGAATGATGAAATCTAATTCTTCCAATAGGGPOI21GAAAATCCATGCTTGTAGCACATCTTTCATGGTTTCAGAAAAGCGATCPOI09TGAAATTGAGATTTAGGATGAAAATCCCTCTGCATATCAAAGPOI22CATATTGTGATGGAAACAGATAATAACCATTGTATCATTGATGAPOI10AGGGAAGTAGCATTAAGACAACATTCTGCGATAACATTGACPOI23ATCAGTCAGAAATCCGTGGGCTCGACGCGGAATTGGATAAGPOI11AGAAAAGAAGAACACCCAGAACTTTAAGGACATGTTTGGCPOI24TGGAGTGATGAAGCACAGACACTAATGCCCAAATTGAATAATGATGTCPOI12CACTTCTCAATATCATAGCGTGTTTCTGAAACAGTTTCCCATPOI25ACCTTTCTTCTCATTGCGTTTCTCTAGAATTTCTCGTTTTCATCPOI13CCACAACTACAAGTAGGTTTCGTGAATGGTGTTCTATTCTPOI26AGACCTAAACCAGGGTCCTAATGAGTCTTGCTGCTTCTCAACATTCTG

2 結(jié)果與分析

2.1 貴州野生白三葉總DNA純度檢測(cè)

0.75%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的22份野生白三葉基因組DNA進(jìn)行了純度檢測(cè)(結(jié)果見圖1)，DNA的完整度較好，蛋白質(zhì)、RNA或其它雜質(zhì)較少。

圖1 22份野生白三葉基因組DNA電泳結(jié)果

2.2 貴州野生白三葉SSR擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性分析

對(duì)26對(duì)引物進(jìn)行篩選，最終確定擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定且多態(tài)性好的20對(duì)引物作為遺傳多態(tài)性標(biāo)記引物(見表3)。用20對(duì)引物對(duì)22份野生白三葉材料進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增，引物擴(kuò)增結(jié)果見表3。共擴(kuò)增出202條帶，其中169條帶具有多態(tài)性，多態(tài)性位點(diǎn)的百分率為83%，引物POI 05多態(tài)性最好，達(dá)92.31%，POI 11多態(tài)性最低，僅62.50%。每對(duì)引物的多態(tài)性條帶數(shù)為5～12條，平均每對(duì)引物產(chǎn)生8.3條多態(tài)性帶。引物POI 02擴(kuò)增出的條帶最多，為17條，其擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶數(shù)也最多，有15條，而引物POI 26擴(kuò)增出的條帶數(shù)最少，僅有6條。20對(duì)引物的多態(tài)信息含量范圍在0.387 3～0.499 0之間，平均為0.474 7，引物POI 14最高，而POI 02最低。不同SSR引物的標(biāo)記指數(shù)在2.485 5～5.809 5之間，平均為3.96。其中POI 17、POI 05、POI 10和POI 02的標(biāo)記指數(shù)值較高，說明這4對(duì)引物對(duì)白三葉具有較高的擴(kuò)增效率。由此可知，SSR-PCR分子標(biāo)記可以較好地檢測(cè)白三葉遺傳位點(diǎn)，通過SSR分子標(biāo)記PCR擴(kuò)增可獲得的較好結(jié)果。

圖2 引物POI 02 22份野生白三葉種質(zhì)SSR擴(kuò)增電泳圖

表3 白三葉種質(zhì)資源SSR分析各引物擴(kuò)增結(jié)果

引物擴(kuò)增總帶數(shù)(TNB)產(chǎn)生的多態(tài)性條帶數(shù)(NPB)多態(tài)性比例(%)(DPB)多態(tài)性信息含量(PIC)標(biāo)記指數(shù)(MI)POI078787.500.46883.2816POI08111090.910.47694.769POI09111090.910.49234.923POI10121083.330.49134.913POI118562.500.49842.492POI129888.890.45713.6568POI138787.500.49773.4839POI266583.330.49712.4855POI0410770.000.49673.4769POI039666.670.49162.9496POI02171585.710.38735.8095POI05131292.310.47245.6688POI069888.890.44943.5952POI01121083.330.47154.715POI259777.780.46283.2396POI247685.710.48512.9106POI2210990.000.45414.0869POI148675.000.49902.994POI1611981.820.48594.3731POI17141285.710.46035.5236總數(shù)20216916589.495778.19平均值10.18.4583.000.47483.96

圖3 22份野生白三葉種質(zhì)SSR分子標(biāo)記基于Nei-Li的相似系數(shù)的UPGMA聚類圖

2.3 貴州野生白三葉UPGMA法聚類結(jié)果

根據(jù)白三葉種質(zhì)間Nei-Li相似系數(shù)進(jìn)行聚類分析(圖3)。當(dāng)相似系數(shù)為0.64時(shí)，22份貴州野生白三葉被分成3類：第1類是W 14(六枝特區(qū)平寨鎮(zhèn)塔山村)，從SSR 標(biāo)記來看，W 14與其余材料的遺傳距離較遠(yuǎn)，最早被分開獨(dú)立成一類。第2類包括W 2、W 4、W 8、W 18，即來自臺(tái)江縣臺(tái)供鎮(zhèn)萬(wàn)畝草場(chǎng)、鳳崗縣龍泉鎮(zhèn)柏梓村、綏陽(yáng)縣及七星關(guān)區(qū)歷陽(yáng)山品種間遺傳距離較近，表明這4個(gè)品種差異不大。第3類為剩下的17個(gè)品種，品種間有著復(fù)雜的遺傳關(guān)系。當(dāng)相似系數(shù)在0.67時(shí)，可將第3大類細(xì)分成3個(gè)聚類，W 1和W 20的遺傳距離較小，聚為一小類。W 6和W 13聚為一類，其余的聚為一類。由表4可知，22份白三葉Nei-Li相似系數(shù)進(jìn)行聚類與遺傳距離具有較好的一致性。

3 討 論

3.1 SSR分子標(biāo)記在白三葉種質(zhì)資源多態(tài)性研究中的應(yīng)用

遺傳多樣性研究是生物多樣性的重要組成部分，也是種質(zhì)資源合理開發(fā)利用的理論基礎(chǔ)，因此，開展白三葉遺傳資源的多樣性分析可為培育優(yōu)良品種提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。由于SSR分子標(biāo)記可檢測(cè)到DNA分子結(jié)構(gòu)上的變異，從本質(zhì)上反映研究材料的差別，具有共顯性、穩(wěn)定性好、靈敏度高及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[21]，已廣泛應(yīng)用于生物進(jìn)化、分子標(biāo)記輔助育種及生物遺傳多樣性等研究領(lǐng)域[22-23]。

表4 貴州22份野生白三葉基于SSR分析遺傳距離

W1W2W3W4W5W6W7W8W9W10W11W12W13W14W15W16W17W18W19W20W21W22W10W20.18890W30.16370.21490W40.18310.40010.14060W50.34040.38230.33640.25440W60.29720.35270.36140.31540.27700W70.22930.26810.26590.24390.36110.28840W80.24390.18490.31130.34610.32010.32260.21830W90.26110.31310.30580.26310.36540.32880.24500.40430W100.3530.35580.31290.27900.22740.30940.22160.38610.32530W110.21280.30540.28490.32570.36120.34890.32240.32150.28820.35960W120.28060.24420.25840.22830.36360.32160.25120.42420.39750.43850.25630W130.24950.28340.28750.32140.35700.18310.24920.37240.42730.49620.2640.21160W140.47440.31620.55580.46630.48250.36850.52820.45270.41430.56230.63040.56820.5280W150.32410.32330.28150.33930.43250.43940.37510.37150.33030.36290.32680.24520.32260.46540W160.31270.33750.31010.27650.3570.35650.34170.32890.30050.35540.38050.2520.15980.43910.36480W170.22970.24320.32010.32010.42310.37240.37070.37060.38760.31840.40530.27060.29190.47970.29780.26920W180.34450.36350.32560.22560.37810.41230.32730.39520.39140.46940.43620.33980.32230.44170.41870.43590.34410W190.22710.26010.29450.30580.41810.49260.42730.32460.38010.33900.40170.27920.35970.39490.37970.39710.29920.39140W200.17210.45290.41790.34800.48710.44810.33820.35580.35120.33470.42260.24350.28480.47310.32610.29620.36720.37140.3390W210.32450.30120.31790.28590.15670.28590.25150.39470.40270.35110.41110.31450.32160.43210.31570.38630.38130.35670.45260.32250W220.32450.32790.30880.28020.46470.43500.31720.36800.38410.43180.39270.30350.31520.39650.32310.33910.40710.36120.39690.27190.39840

SSR分子標(biāo)記可以運(yùn)用于白三葉種質(zhì)資源材料的識(shí)別、區(qū)分，且多態(tài)性較高。本研究篩選出20對(duì)多態(tài)性較高的SSR引物，平均擴(kuò)增出的多態(tài)性比率為83.0%，高于安曉珂[24]利用RAPD標(biāo)記引物擴(kuò)增出的多態(tài)性比率(75%)和李潤(rùn)芳[25]利用SRAP標(biāo)記得到的引物多態(tài)性比率(53.8%)，而牟彤[14]利用SSR標(biāo)記對(duì)經(jīng)秋水仙素誘變的白三葉突變體進(jìn)行擴(kuò)增的多態(tài)性比率高達(dá)92.1%。可用SSR標(biāo)記位點(diǎn)的平均PIC值來評(píng)價(jià)白三葉群體的遺傳多樣性水平，PIC值越高則群體的SSR標(biāo)記位點(diǎn)變異程度越大，群體的遺傳多樣性也越豐富。本研究中，22份貴州野生白三葉的SSR標(biāo)記位點(diǎn)的平均PIC值為0.474 8，較張婧源[9]研究的70份白三葉材料的SSR標(biāo)記位點(diǎn)的平均PIC值(0.334 2)高，表明貴州野生白三葉種質(zhì)資源的遺傳多樣性十分豐富，這可能與貴州特殊的喀斯特生境及復(fù)雜多樣的小氣候有關(guān)，可開展進(jìn)一步研究。

3.2 供試材料間的親緣關(guān)系分析

親本材料的選擇是育種工作的重要基礎(chǔ)，遺傳基礎(chǔ)狹窄將阻礙著突破性品種的培育。在白三葉的遺傳改良和變異篩選工作中，可優(yōu)先選擇遺傳多樣性較豐富的材料作為親本，并優(yōu)先考慮在含特有等位基因的材料中進(jìn)行優(yōu)良變異單株的選擇。因此研究親本材料的遺傳多樣性，比較分析材料相互間親緣關(guān)系，對(duì)于培育優(yōu)質(zhì)品種具有重要的指導(dǎo)意義。

本研究中，聚為第3大類的17份材料的遺傳距離小，親緣關(guān)系較近，遺傳基礎(chǔ)狹窄，不適合進(jìn)行親本雜交，需引入新材料，拓展親本遺傳基礎(chǔ)。而W 14與其余材料的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可以考慮將其作為雜交親本。張婧源[9]曾用SRAP和SSR標(biāo)記分析70份白三葉材料間遺傳多樣性，測(cè)得其相似系數(shù)平均值分別為0.730 7和0.661 3。李潤(rùn)芳等[26]對(duì)7份白三葉進(jìn)行SRAP標(biāo)記分析，平均遺傳相似系數(shù)為0.854。以上結(jié)果表明，所用遺傳標(biāo)記不同或供試材料不同，所獲得的白三葉遺傳多樣性的結(jié)論也存在一定的差異。為此，若想更準(zhǔn)確、全面地了解白三葉遺傳多樣性，應(yīng)對(duì)比分析多種不同的遺傳標(biāo)記。

4 結(jié) 論

本研究篩選出20對(duì)多態(tài)性較好的SSR引物，平均擴(kuò)增出的多態(tài)性比率較高(83.0%)，表明貴州野生白三葉種質(zhì)的遺傳多樣性十分豐富。在育種工作中，因W14與其余材料的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可以考慮將其作為雜交親本，培育新的優(yōu)良性狀的雜交品種。

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