馮婷婷 楊超一 張雪峰 王 斌

(原子高科股份有限公司，北京 102413)

臨床醛固酮(Aldosterone，ALD)含量檢測主要用于篩查原發(fā)性ALD增多癥(原醛癥)引起的繼發(fā)性高血壓患者，該類患者占總高血壓患者的5%～15%。與原發(fā)性高血壓患者相比，原醛癥患者心、腦等靶器官損害更為嚴重，故早期診斷至關(guān)重要[1- 4]。目前，檢測血清或血漿中腎素活性(PRA)、血管緊張素Ⅱ(AⅡ)和ALD三個臨床指標是原發(fā)性和繼發(fā)性高血壓分型診斷、治療及研究的重要指標[5- 7]。另外，大量臨床研究表明，ALD升高是慢行心率衰竭發(fā)生發(fā)展的重要致病機制，它可以促進儲鈉排鉀、激活交感神經(jīng)，并促進心肌和血管壁外纖維化[5,8,9]。

ALD與血漿中白蛋白結(jié)合能力很差，與血漿皮質(zhì)類固醇結(jié)合球蛋白(Corticosteroid binding globulin，CBG)相結(jié)合很少，大部分以游離形式存在，更新速度較快[10]。每100 ml外周血中約含有8 ng ALD，含量微小，卻能表現(xiàn)較為強大的生理功能[10]。ALD在血液中的含量甚微，給臨床的定量檢測帶來巨大挑戰(zhàn)，目前臨床多采用通過抗原抗體反應(yīng)的免疫分析方法檢測血清中的ALD[11- 13]。本工作通過制備高靈敏度的ALD抗體，使用生物素- 鏈霉親和素系統(tǒng)，建立了高靈敏度的ALD化學發(fā)光檢測方法。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器 化學發(fā)光免疫分析儀(BHP9507型)為北京濱松光子技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；Spectra酶標儀：奧地利SLT公司產(chǎn)品；UV- 2800H紫外分光光度計由尼柯(上海)儀器有限公司生產(chǎn)。

1.1.2主要試劑 健康清潔級新西蘭白兔，雌性，購自北京大學醫(yī)學部；醛固酮、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FICA)、生物素和鏈霉親和素- HRP均購自Sigma公司；96孔化學發(fā)光板為Nunc公司產(chǎn)品；發(fā)光底物、羊抗兔酶標二抗由原子高科股份有限公司提供；碘[125I]醛固酮放射免疫分析藥盒為北京北方生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；95份血漿樣本來源于中國核工業(yè)北京四零一醫(yī)院，醛固酮檢測值已由該醫(yī)院用碘[125I]醛固酮放射免疫分析藥盒測定；實驗所用其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2實驗方法

1.2.1ALD免疫原的制備 醛固酮肟的制備：稱取10 mg ALD、5mg 羧甲基羥胺和10 mg無水醋酸鈉一起溶解在2.5 ml甲醇中，在27～38℃，電磁攪拌2 h，減壓抽干，加入5 ml冷重蒸餾水，在冰浴中用1 mol/L HCl調(diào)至pH=2，出現(xiàn)白色沉淀，冰箱放置3 h，再用10 ml×3冷乙醚提取。提取液減壓抽干，得9.7 mg醛固酮肟(黃色膠狀)。

ALD- BSA和ALD- OVA的制備：取醛固酮肟11 mg，N- 羥基琥珀酰亞胺(NHS)22 mg和1- (3- 二甲氨基丙基)- 3- 乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)11 mg，將這三種化合物分別溶于0.5、0.25和0.25 ml DMSO中，混合后在25～30℃，電磁攪拌6 h，即為A液；稱取10 mg BSA或OVA，將其溶解在2 ml 0.05 mol/L 酸氫鈉溶液中，所得溶液為B液。將A液逐滴滴加至B液，混合后在4℃電磁攪拌過夜，反應(yīng)完成后即為ALD- BSA或ALD- OVA。用0.02 mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液徹底透析。

1.2.2ALD多克隆抗體的制備 免疫動物為3～4月齡，體重1.5～2 kg的新西蘭大白兔。將ALD- BSA免疫原稀釋至1 g/L，并用等體積弗氏完全佐劑進行乳化，在新西蘭白兔的背部采用皮內(nèi)多點注射進行首次免疫，免疫劑量為1 mg/只，共免疫5只。隔2周進行第二次免疫，免疫劑量減半，并采用弗氏不完全佐劑進行乳化。以后每隔4周加強免疫一次，免疫劑量與第二次相同。免疫后第42天耳緣靜脈采血，測定抗血清的滴度，以后每隔4周采血并測滴度。當?shù)味炔辉偕邥r，選擇滴度較高，特異性較好的兔，從兔頸動脈采血，分離血清。將分離出的大部分血清-20℃凍存。少量血清采用Protein- G親和層析柱進行純化，并用紫外分光光度法根據(jù)公式：蛋白濃度=1.45×OD280nm值-0.74×A260nm值，計算蛋白濃度。

1.2.3抗血清的滴度及50%抑制率(IC50)的ALD濃度的鑒定 兔抗ALD特異性抗血清的滴度及IC50采用間接ELISA方法進行測定，ELISA的操作步驟如下：將2 μg/ml(100 μl/孔)ALD- OVA包被于聚苯乙烯微量滴定板上。包被板封閉后加入抗血清37℃溫育1 h后洗板，抗血清的加入方法根據(jù)檢測內(nèi)容不同分兩種：①如果檢測抗血清滴度：向已封閉的包被板中加入稀釋到不同濃度的抗血清(100 μl/ 孔)；②如果檢測IC50：向已封閉的包被板中加入一定濃度的抗血清(50 μl/孔)和ALD標準品(50 μl/ 孔)。洗板后加入羊抗兔酶標二抗(1∶3 000稀釋，100 μl/孔)，37℃溫育30 min后洗板。加入底物(100 μl/孔)37℃溫育15 min，加2 mol/L H2SO4(50 μl/孔)終止反應(yīng)，最后用酶標儀測定每孔OD450nm吸光值。

將待測抗血清系列稀釋，用間接ELISA方法測定抗血清滴度，以O(shè)D450nm值與陰性對照OD450nm值的比值≥2時的稀釋倍數(shù)為陽性抗血清滴度。

同時加入一定濃度的抗血清和ALD標準品，用間接ELISA方法測定IC50，50%抑制濃度的計算方法為：B(添加了ALD的孔的OD450nm值)/B0(不添加ALD的對照孔的OD450nm值)=50%時所對應(yīng)的濃度。

1.2.4化學發(fā)光免疫分析法的建立

1.2.4.1標準品的配制 先用二甲基甲酰胺將ALD配制成1 mg/ml，再用去激素人血清將ALD配制成 0、62.5、125、250、500、1 000和2 000 pg/ml，然后以1.0 ml/瓶分瓶凍干，4℃保存，使用前用1.0 ml去離子水復(fù)溶。

1.2.4.2固相抗體的制備 ALD- OVA用包被緩沖液稀釋至0.05 μg/ml，200 μl/孔包被于發(fā)光板上，4℃包被過夜。次日，包被板用洗滌緩沖液洗一次，用封閉液(250 μl/孔)37℃封閉1 h。

1.2.4.3生物素標記ALD抗體的制備[14]首先用二甲基甲酰胺溶解生物素濃度為 10 mg/ml，然后取 200 μg 生物素加入1 mg 抗ALD多克隆抗體(溶于 500 μl 0.05 mol/L 的 NaHCO3)中,混勻,室溫放置30 min，然后用 0.02 mol/L pH7.4的磷酸緩沖溶液徹底透析，取出后加入等體積甘油置于-20℃保存。

1.2.4.4生物素標記ALD抗體稀釋液配制 0.02 mol/L磷酸緩沖液，pH7.4，含0.1%檸檬酸鈉、1%BSA、0.05% 8- 苯胺- 1- 萘磺酸和0.05%Tween20。

1.2.4.5ALD- OVA包被濃度和生物素標記抗體工作濃度的選擇 ALD- OVA包被濃度和生物素標記抗體工作濃度是對ALD分析靈敏度起著至關(guān)重要的兩個因素，互相制約，因此通過正交實驗選擇包被濃度和生物素標記抗體工作濃度。包被濃度分別選擇0.02、0.05、0.1和0.2 μg/ml生物素標記抗體工作濃度分別稀釋為1∶200、1∶500、1∶1 000和1∶2 000 倍,通過免疫分析結(jié)果確定最佳條件。

1.2.5方法學評價

1.2.5.2精密度測定 將3份含低、中、高不同濃度ALD的血漿樣本分別在一次實驗中平行測定10次，在不同實驗中重復(fù)測定8次，計算批內(nèi)和批間變異。

1.2.5.3健全性測定 將一份高濃度血漿樣本倍比稀釋后測定，繪制稀釋度與測定值的線性相關(guān)曲線。

1.2.5.4回收率測定 將不同濃度的ALD標準品與同一份正常人血漿1∶1混合，進行測定。將測定結(jié)果與理論值進行比較,計算本方法的回收率。

1.2.6方法學比較 將本方法檢測的結(jié)果與用放射免疫分析法檢測的95份血漿樣本的檢測值進行比較，計算兩種方法的相關(guān)性。

1.3統(tǒng)計學處理 實驗操作中均采用的平行雙孔實驗，對實驗結(jié)果的信號值每2孔取平均值后再用EXCEL對數(shù)據(jù)進行處理，得到相應(yīng)的數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果

2.1兔血清采血時間的確定和兔血清的篩選 用ALD- OVA包被，測定各兔血清滴度和抑制水平變化曲線。由圖1、2可見，免疫ALD- BSA的5只兔血清效價在第5次免疫之后維持在水平狀態(tài)，抑制水平在5免后也基本維持在水平狀態(tài)，因此確定在免疫第6次后第21天采血。同時對免疫第6次后的血清做比較，由表1可見1、2和3號兔子抗血清滴度較高分別是160 000、80 000和80 000，其中ALD對第1和3號兔子的抗血清抑制比較好，1號和3號兔子的IC50分別是287和268 pg/ml。因為ALD在血液中的含量甚微，最終選擇IC50最低的3號兔子。

圖1 各兔血清滴度水平變化曲線Fig.1 Change curves of serum titers in different rabbits

圖2 各兔血清抑制水平變化曲線Fig.2 Change curves of serum inhibitory levels in rabbits

表1血清滴度和抑制水平的比較

Tab.1Comparisonofserumtiterandinhibitionlevel

NumberSerumtiterIC50(pg/ml)1160000287280000845380000268440000527520000345

表2ALD-OVA包被濃度和生物素標記抗體工作濃度的選擇

Tab.2SelectionofALD-OVAcoatingconcentrationandbiotinlabeledantibodyconcentration

BiotinlabeledantibodyconcentrationCoatingconcentration(μg/ml) 0.02 B62.5pg/B0%rvalue 0.05 B62.5pg/B0%rvalue 0.1 B62.5pg/B0%rvalue 0.2 B62.5pg/B0%rvalue1∶20095.30.99289.70.99594.80.99295.30.9901∶50092.70.99387.50.99792.60.99593.70.9921∶100094.80.99089.30.99589.60.99192.40.9911∶200095.50.99089.80.99390.80.99092.60.991

圖3 ALD化學反光免疫分析標準曲線Fig.3 Standard curve of chemiluminescence immunoa- ssay for ALD

表3精密度測定結(jié)果

Tab.3Resultsofprecisionmeasurement

Sampleconcentration(pg/ml)Intra-assayvariation(n=10)x-2SD(pg/ml)CV/%Inter-assayvariation(n=8)x-2SD(pg/ml)CV/%74.665.1±6.29.568.5±8.712.7244.2216.6±17.38.0223.4±19.68.8654.8633.5±43.96.9653±55.98.5

2.2ALD- OVA包被濃度和生物素標記抗體工作濃度的選擇 實驗結(jié)果見表2，根據(jù)此結(jié)果選擇包被濃度0.05 μg/ml，生物素標記抗體工作濃度1∶500，該條件B62.5 pg/B0%值為87.5%，靈敏度最高，線性相關(guān)系數(shù)r值較高為0.997，標準曲線線性較好。

2.3方法學評價

2.3.1標準曲線 通過前面的方法學優(yōu)化，建立了ALD的化學發(fā)光檢測法，該方法的標準曲線見圖3。 標準曲線方程為y=-2.292x+6.099，r=0.997。

圖4 稀釋實驗Fig.4 Dilution test

表4回收率測定結(jié)果

Tab.4Resultsofrecoverytest

ALDtheoreticalvalue(pg/ml)ALDmeasuredvalue(pg/ml)Recoveryrate(%)250260.4104.1500472.694.51000931.193.1

2.3.3精密度 本方法的批內(nèi)和批間變異結(jié)果見表3。 批內(nèi)變異系數(shù)為6.9%～9.5%，批間變異系數(shù)為8.5%～12.7%?？梢姳痉椒ǖ木芏容^好，符合免疫分析的要求。

2.3.4健全性本方法的稀釋度與測定值的線性相關(guān)曲線 如圖4所示，經(jīng)計算測定值和稀釋度的相關(guān)性方程為:y=607.03x-8.625，相關(guān)系數(shù)r=0.996。

2.3.5回收率測定 結(jié)果見表4。將測定結(jié)果與理論值比較,本方法的回收率范圍為93.1%～104.1%，說明本方法準確度較好。

2.4方法學比較 本方法和放射免疫分析法分別檢測95例血漿樣本，結(jié)果見圖5?？梢姳痉椒ㄅc放射免疫分析方法的相關(guān)性方程為y=0.932x+4.596，相關(guān)系數(shù)r=0.948。 說明本方法與放射免疫分析方法具有良好的相關(guān)性。

圖5 本方法與放射免疫分析方法的相關(guān)性Fig.5 Correlation between this method and radioimmunoassay

3 討論

ALD分泌過多可引起高血壓、低血鉀等表現(xiàn)。臨床常見的ALD增多癥是引起繼發(fā)性高血壓的原因之一，因此測定血液中的ALD含量具有重要的臨床意義，但因含量甚微，又受其他類固醇激素的干擾，其檢測的靈敏度和特異性均不夠理想。

本工作首先制備了高靈敏度的ALD抗體。ALD是一種類固醇類激素，分子量為360.44，直接免疫動物不能產(chǎn)生免疫原性，必需將其與大分子的載體蛋白，如牛血清白蛋白、卵清蛋白或血藍蛋白進行偶聯(lián)才能產(chǎn)生免疫原性。ALD其結(jié)構(gòu)上只有酮基、醛基和羥基，不能直接與載體蛋白上的氨基或羧基進行偶聯(lián)，因此我們對ALD的結(jié)構(gòu)進行改造，利用ALD的酮基和羧甲基羥胺的氨基縮合，在ALD上引入了羧基。用新引入的羧基可以和載體蛋白上的氨基進行偶聯(lián)制備免疫原。用獲得的免疫原免疫5只新西蘭白兔，5只都獲得了較高的滴度，其中3號IC50值最低，為268 pg/ml，為了獲得更高檢測靈敏度，選擇IC50值最小的3號兔子血清純化抗體，進一步用于化學發(fā)光免疫分析方法的建立。

ALD在血液中的含量甚微，在普通進食情況下，臥位采血正常參考值范圍為60～174 pg/ml，立位采血為68～296 pg/ml，因此我們建立檢測方法的靈敏度最好能≤50 pg/ml。為了提高靈敏度我們采用了鏈霉素親和素-生物素放大系統(tǒng)，該系統(tǒng)在抗ALD抗體上標記了多個生物素，每個生物素通過高親和力的非共價結(jié)合了辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素，即增加了抗體上標記酶的數(shù)量，由此對化學發(fā)光信號進行放大，以提高ALD檢測方法的靈敏度。

國外已有ALD單抗的制備以及ALD的時間分辨熒光免疫分析或化學發(fā)光免疫分析方法的相關(guān)報道，但沒有對ALD免疫原制備過程的詳細描述[11- 13,15,16]。本文詳細敘述了ALD免疫原的制備過程，并驗證用該免疫原可以獲得高靈敏度的抗ALD的多抗。本方法對ALD檢測靈敏度是23.7 pg/ml，檢測范圍為62.5～2 000 pg/ml。Sun等[11]報道其所建立的SALD熒光免疫分析方法的檢測靈敏度為15 pg/ml，檢測上限為1 000 pg/ml。該作者報道基于Luminex公司的流式熒光技術(shù)(Flexible multi- analyte profiling，xMAP)所建立的ALD檢測靈敏度為9.8 pg/ml，檢測范圍為10～1 000 pg/ml[12]。與Sun等[11，12]報道的ALD檢測方法相比，本方法的靈明度略差于Sun等建立的兩種方法的靈敏度，主要可能與所用抗體的靈敏度存在差異有關(guān)。但本方法的檢測范圍更寬，可能是因為本方法引入了鏈霉素親和素- 生物素放大系統(tǒng)對發(fā)光信號進行了放大從而提高了檢測范圍。經(jīng)過方法學鑒定本方法的各項指標也符合臨床應(yīng)用的基本要求，因此，本工作的完成為ALD化學發(fā)光免疫分析試劑盒的國產(chǎn)化奠定了基礎(chǔ)。

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