鄧六勤，黎梅桂，吳寶儀

(廣東省廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣東廣州510000)

黃芪為豆科植物膜莢黃芪、蒙古黃芪、多序巖黃芪或紅芪的干燥根，味甘，性微溫，具有補氣固表、利水退腫、脫毒排膿、生肌等功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪具有調(diào)節(jié)免疫、增強體質(zhì)、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤及改善心肌缺血等功能[2－4]。黃芪的主要化學成分有黃酮類、皂苷類、黃芪多糖、氨基酸等[5]，黃芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）是黃芪中最主要的活性成分[6]，具有增強機體抵抗力，促進抗體生成，增強免疫力，雙向調(diào)節(jié)血糖和保護心血管系統(tǒng)等作用[7－8]，目前廣泛用于中醫(yī)臨床制劑和動物飼料[9]。黃芪多糖的組成較復(fù)雜，其相對分子質(zhì)量為10～50 kD[10]。黃芪多糖具有一定的生物學活性，但由于其相對分子質(zhì)量大，溶解性差，不易被吸收，故在應(yīng)用方面受到很大限制。李紅法等[11]采用乙醇分級沉淀法提取黃芪多糖，獲得了不同相對分子質(zhì)量的黃芪多糖，表明隨著黃芪多糖相對分子質(zhì)量的降低，抗氧化活性增強。故采用適宜的方法將黃芪多糖相對分子質(zhì)量降低，有助于提高其生物活性。本研究中采用維生素C（Vit C）和過氧化氫體系誘導產(chǎn)生的自由基降解黃芪多糖，制備低相對分子質(zhì)量黃芪多糖，并研究其抗氧化、抗腫瘤活性，為探討低相對分子質(zhì)量黃芪多糖在抗腫瘤藥物和保健食品中的應(yīng)用提供試驗依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：T1000型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；HWS24型電熱恒溫水浴鍋（上海－恒科技有限公司）；Eyela N－1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；OSB－2100型油浴鍋（上海愛朗儀器有限公司）；SHB－3型循環(huán)水多用真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；CO2細胞培養(yǎng)箱；顯微鏡；酶標儀（Bio－Rad Inc.USA）。

試藥：FeCl2·4H2O（天津市大茂化學廠，批號為20151220）；H2O2（天津市大茂化學廠，批號為20160720）；水楊酸（天津市致遠化學試劑有限公司，批號為20150208）；鄰苯三酚（天津市致遠化學試劑有限公司，批號為20160315）。以上試劑均為分析純。去離子水(實驗室自制)；黃芪購買于清平中藥材市場，經(jīng)鄧六勤副主任中藥師鑒定為中藥黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge。藥材打粉后，過4號篩，備用。

1.2 方法

1.2.1 鐵皮石斛粗多糖的提取分離

取黃芪粉末約100 g，精密稱定，用石油醚回流提取2 h，過濾，棄去濾液，濾渣重新用80%乙醇回流提取2 h，除去可溶性雜質(zhì)，包括色素、游離糖等。處理后的黃芪粉末加入去離子水，回流提取2 h，連續(xù)提取3次，合并濾液。合并的濾液以4 000 r／min的速率離心10 min。減壓濃縮上清液，濃縮液加入4倍體積的無水乙醇，低溫冷藏，靜置過夜。離心，沉淀置60℃的烘箱中烘干。用熱水溶解烘干的粗多糖，用Sveag法脫蛋白，重復(fù)3～5次。脫蛋白后的多糖用無水乙醇沉淀，靜置過夜，離心，60℃烘干，得到黃芪粗多糖。

1.2.2 H2O2－Vit C－Fe2＋氧化降解粗多糖的提取

稱取1.2.1項下得到的粗多糖3.2 g，置500 mL錐形瓶中，加320 mL純水使其溶解，加入新鮮配制的不同量的100 mmol的Vit C，1 000 mmol的FeCl2·4H2O，1 000 mmol H2O2，置暗處反應(yīng)2 h。然后將反應(yīng)液置于300Da透析袋中，在純水中透析2 d，透析液以7000r／min的速率離心10 min，冷凍干燥上清液，得不同降解片段的粗多糖。

1.2.3 多糖相對分子質(zhì)量測定

黃芪多糖降解片段樣品及標準多糖Dextran standard系列樣品分別經(jīng)高效液相凝膠滲透色譜(HPGPC)分析，所用儀器為Agilent 1100 series型高效液相色譜（HPLC）主機，配置示差折光檢測器，分析柱為TSK G4000PWXL（300 mm×7.5 mm）和TSK G5000PWXL（300 mm×7.8 mm）串聯(lián)柱樣品質(zhì)量濃度為1.5 g／L；進樣量為20 μL；流動相為醋酸鈉；檢測器靈敏度為4；柱溫為40℃；流速為0.6 mL／min。葡聚糖標準品(相對分子質(zhì)量1 270，5 220，11 600，23 800，48 600，80 900，147 600，273 000，409 800，667 800)建立標準曲線。

1.2.4 抗氧化活性測定

對O2·的清除作用：取5 g／L的多糖樣品溶液50 μL，125 μL Tris緩沖液，25 μL鄰苯三酚，迅速混勻，于325 nm波長下測定吸光度(A)，每30 s測1次，連續(xù)測5 min，以水代替樣品測A0，ΔA為線性回歸方程的回歸系數(shù)。清除率＝（1－ΔA／ΔA0）×100%。

對·OH的清除作用：取2 mL不同質(zhì)量濃度（0.5，1，2，3，5 g／L）的多糖樣品與2 mL 6 mmol／L FeSO4，2 mL 2.4 mmol／L H2O2混合，搖勻，靜置10 min，再加入6 mmol／L的水楊酸2 mL，搖勻，37℃水浴30 min，4 000 r／min離心10 min，上清液于510 nm波長處測定Ai，用1 mL水代替樣品測定A0，用2 mL水代替H2O2溶液測定Aj。清除率＝[1－(Ai－Aj)]／A0×100%。

1.2.5 體外抗腫瘤活性測定

細胞株及培養(yǎng)條件：人肝癌細胞株HepG－2常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d換液1次，取對數(shù)生長期細胞用于試驗。

MTT法檢測細胞生長抑制率：細胞以5×104／孔接種于96孔板，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，次日細胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，加入質(zhì)量濃度為10，25，50，100，400 μg／mL的黃芪多糖培養(yǎng)液100 μL，每個質(zhì)量濃度設(shè)5孔，同時設(shè)無藥陰性對照組5孔，以及陽性對照組5－氟尿嘧啶（5－FU），質(zhì)量濃度為100 μg／mL，設(shè)5孔；然后置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24，36，48 h；取出后加入5 g／L的MTT溶液20 μL，37℃避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h；每孔加二甲基亞砜（DMSO）150 μL，震蕩10 min，混勻使甲瓚結(jié)晶充分溶解；置酶標儀490 nm波長下檢測各孔吸光度(OD)，取5個復(fù)孔的均值為最終結(jié)果；計算細胞抑制率，細胞抑制率＝(陰性對照組OD值－多糖組OD值)／陰性對照組OD值×100%。

2 結(jié)果

2.1 氧化降解

黃芪粗多糖用不同質(zhì)量濃度的H2O2－Vit C－Fe2＋氧化降解后，共得到6個降解片段，冷凍干燥后稱定質(zhì)量。不同相對分子質(zhì)量多糖片段的降解方法和得率見表1。

2.2 相對分子質(zhì)量測定

系列相對分子質(zhì)量標準品的HPGPC分析保留時間見表2。以保留時間計算各自的分配系數(shù)(Kaw)作橫坐標、相對分子質(zhì)量為縱坐標，線性回歸方程為Y＝－0.3109X＋13.148(R2＝0.994 5)。黃芪粗多糖及其降解片段洗脫峰型對稱，由線性回歸方程及樣品保留時間可計算出黃芪多糖相對分子質(zhì)量結(jié)果為：粗多糖269 459.60 u，片段1為74 446.11 u，片段2為105 006.92 u，片段3為167 793.73 u，片段4為87 565.35 u，片段5為133 226.45 u，片段6為96 574.76 u。

表1 氧化降解因素水平表

表2 標準品的HPGPC分析保留時間

2.3 黃芪多糖體外抗氧化活性研究

2.3.1 對羥基的清除作用

黃芪粗多糖及其降解片段對·OH的清除作用效果見圖1 A。線性范圍為0.5～5.0 g／L，陽性藥Vit C對·OH的清除效果非常明顯，清除率近100.00%。由圖1 A可見，粗多糖和6個降解片段對羥基的清除能力均隨質(zhì)量濃度的增高而增大，5 g／L片段1清除率已超過60%。降解片段1～6和降解前的粗多糖的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為1.669，7.043，12.742，2.428，9.641，2.573 g／L。6個降解片段的清除效果均比粗多糖好，且清除作用1＞4＞6＞5＞2＞3。

2.3.2 對超氧基的清除作用

黃芪粗多糖及其降解片段對O2·的清除作用效果見圖1 B。線性范圍為0.5～5.0 g／L，陽性藥Vit C對O2·的清除效果非常明顯，清除率趨近100.00%。由圖1 B可見，黃芪多糖對O2·的清除作用較弱。黃芪粗多糖降解前對O2·的清除率在質(zhì)量濃度為5 g／L時為40.1%。降解后的多糖片段清除作用有所增強，片段1在質(zhì)量濃度為5 g／L時清除率達66.4%。降解片段1，4，6清除作用明顯優(yōu)于粗多糖，也比片段2，3，5清除效果好。可見，6個降解片段的清除效果均比粗多糖好。

2.4 體外抗腫瘤活性

圖1 黃芪粗多糖及其降解片段清除作用

體外抗腫瘤活性采用MTT法評價。陽性對照藥為5－Fu，24，48 h時的抑制率為51.32%和61.47%，檢測正常，可作為比較。黃芪粗多糖及其降解片段1，4，6清除自由基的能力較強，故抗腫瘤活性選擇片段1，4，6作進一步研究。在質(zhì)量濃度為50～800 μg／mL范圍內(nèi)處理HepG－2，分別于24，48 h時測定對HepG－2的生長抑制作用，細胞存活率見圖2?？梢姡S芪多糖對HepG－2的生長抑制存在濃度依賴性，隨著給藥質(zhì)量濃度的增大，細胞活性降低。

由圖2可見，給藥48 h比給藥24 h時抑制作用強，說明黃芪多糖對HepG－2抑制作用存在時間依賴性。降解片段1對HepG－2抑制作用較突出，24 h時和48 h時的抑制作用均比其他多糖強，48 h時在給藥質(zhì)量濃度為800 μg／mL時，其抑制率達57%。雖然降解片段6在800 μg／mL時略微低于粗多糖，該給藥質(zhì)量濃度非常高，但差異不明顯。可見，無論是24 h時還是48 h時，各給藥質(zhì)量濃度下，黃芪多糖降解片段均表現(xiàn)出更好的抗HepG－2活性，高于降解前的粗多糖的活性。

3 討論

圖2 不同濃度的黃芪多糖對HepG－2細胞的抑制效果

多糖是來源于高等植物、動物細胞膜及微生物細胞壁中的一類天然大分子，是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一，廣泛參與細胞間信號轉(zhuǎn)導、細胞分化、再生等各種生命現(xiàn)象?，F(xiàn)代藥理研究表明，多糖具有抗病毒、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)血脂、增強免疫等生物活性，且來源廣泛，不良反應(yīng)少，在食品和新藥研發(fā)領(lǐng)域已受到越來越多的關(guān)注。

目前，國內(nèi)外學者提出的多糖降解方法主要分為化學降解法、物理降解法和生物降解法[12]。多糖在氧化劑的存在下可進行氧化降解，用H2O2氧化降解多糖無毒，無副產(chǎn)物，是較理想的化學降解方法。王琪琳[13]報道，海帶硫酸多糖可被H2O2有效地降解，降解之后海帶硫酸多糖的多糖含量、硫酸根含量及單糖組成基本無變化。孫利芹等[14]用過氧化氫輔助超聲波降解法制備低相對分子質(zhì)量紫球藻多糖，研究表明，相對分子質(zhì)量小的多糖對自由基有明顯的清除作用，相對分子質(zhì)量對其抗氧化活性有顯著影響。

黃芪的多糖含量超過10%，是其主要成分和活性物質(zhì)。大分子的黃芪多糖雖具有一定的生物活性，但由于其相對分子質(zhì)量大，溶解性較差，生物利用率較低，制約了其藥效發(fā)揮。研究表明，黃芪多糖的生物活性與其相對分子質(zhì)量大小相關(guān)。文獻[12]報道采用分步醇沉法對黃芪總多糖進行分離，結(jié)果顯示，不同相對分子質(zhì)量黃芪多糖均有抗氧化作用，且抗氧化能力與其相對分子質(zhì)量大小有關(guān)。

本研究中，通過氧化降解，使黃芪多糖相對分子質(zhì)量降低，得到6個不同相對分子質(zhì)量的粗多糖片段。由基體外抗氧化試驗表明，黃芪多糖降解后的片段抗氧化活性增強，清除羥基的作用比清除超氧基強。然后，用體外抗氧化活性較強的片段進行體外抗腫瘤研究，結(jié)果顯示，降解片段對HepG－2抑制作用比降解前的粗多糖強。

黃芪為補氣佳品[15]，但目前主要作為茶飲或臨床調(diào)配使用，極少有深加工的保健產(chǎn)品。本研究中采用氧化降解的方法降解黃芪多糖，為尋找多糖生物活性較強適宜的相對分子質(zhì)量范圍，提高黃芪的生物利用度，以及為其他中藥材多糖的降解提供參考。同時，本研究中還發(fā)現(xiàn)黃芪多糖具有一定抗氧化、抗腫瘤作用，提示其可在防衰老、抗腫瘤等方面發(fā)揮作用，進一步擴大了黃芪的藥用范圍，為黃芪多糖精加工提供理論依據(jù)，有望開發(fā)為藥品或多糖保健品，以提高黃芪的經(jīng)濟利用價值。

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