龍 彬 李周權(quán) 董國忠 王慶爭 余忠穩(wěn)

(西南大學(xué)動物科技學(xué)院，重慶 400716)

金銀花是忍冬科忍冬屬多種植物的干燥花蕾，是我國的傳統(tǒng)中藥之一[1]。金銀花主要化學(xué)成分為酚酸、黃酮、揮發(fā)類油和三萜皂苷類等[2-3]。金銀花提取物主要的活性成分是綠原酸(chlorogenic acid,CGA)。研究表明，CGA具有抗氧化、抗菌、抗病毒等功能，可以增強(qiáng)機(jī)體免疫力[4]；最新研究表明，CGA在調(diào)控機(jī)體的糖脂代謝方面有顯著作用[5]。目前關(guān)于金銀花提取物對蛋雞蛋黃膽固醇含量和脂質(zhì)代謝的影響鮮有報道。因此，本研究以34周齡京粉2號蛋雞為試驗動物，在飼糧中添加不同水平的金銀花提取物，分別測定蛋雞的生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)、脂質(zhì)代謝和蛋黃膽固醇含量，并探討通過添加金銀花提取物來降低雞蛋膽固醇含量的可能性，為金銀花提取物在蛋雞生產(chǎn)中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

金銀花提取物購于湖南綠蔓生物科技股份有限公司，有效成分CGA含量為25%。

1.2 試驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理

試驗選用同一雞舍內(nèi)產(chǎn)蛋率相近、體重相近、健康狀態(tài)良好的34周齡京粉2號蛋雞600只，隨機(jī)分成4組，每組5個重復(fù)，每個重復(fù)30只雞。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧(不含金銀花提取物)，試驗組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加100、200和300 mg/kg金銀花提取物(有效成分CGA含量分別為25、50和75 mg/kg)的試驗飼糧?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)每千克預(yù)混料包含 One kg of premix contained the following: VA 4 000 000 IU，VD3600 000 IU，VE 20 g，VK3500 mg，VB150 mg，VB23 g，煙酸 nicotinic acid 1 500 mg，泛酸 pantothenic acid 70 mg，葉酸 folic acid 500 mg，氯化膽堿 choline chloride 20 g，F(xiàn)e 60 g，Cu 10 g，Mn 50 g，Zn 70 g，Se 25 mg。

2)營養(yǎng)水平為計算值。Nutrient levels were calculated values.

試驗期間，每天06:30和14:30各喂飼料1次。采用3層階梯式籠養(yǎng)方式，自由采食、飲水。每天光照16 h，并清糞1次。試驗分為預(yù)試期7 d和正試期28 d，共35 d。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 生產(chǎn)性能

以重復(fù)為單位每天記錄蛋重、產(chǎn)蛋數(shù)、投料量、剩余料量、雞只存欄數(shù)、破軟蛋數(shù)，并計算平均蛋重、產(chǎn)蛋率、平均日采食量、破軟蛋率、料蛋比。

1.3.2 蛋品質(zhì)

試驗的最后1天，分別從每組中隨機(jī)采取20個雞蛋(每重復(fù)4個)用于測定雞蛋物理品質(zhì)指標(biāo)，測定指標(biāo)包括蛋形指數(shù)、蛋殼強(qiáng)度、蛋黃顏色、蛋殼厚度、哈夫單位。測定儀器包括蛋質(zhì)檢測儀(沈陽富士平工業(yè)有限公司)、蛋殼強(qiáng)度測定儀(沈陽富士平工業(yè)有限公司)、羅氏比色扇(美國羅氏公司)。

1.3.3 蛋黃膽固醇含量

從每組中隨機(jī)采取10個雞蛋(每重復(fù)2個)測定蛋黃膽固醇含量。煮熟雞蛋，研磨均勻，稱取蛋黃1 g，用甲醇-氯仿溶液(1∶2)研磨至無明顯顆粒，混合8 min，過濾至10 mL容量瓶，并補(bǔ)充甲醇-氯仿溶液定容，待用。分別取0.02 mL蛋黃濾液、膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液、甲醇-氯仿溶液加入樣品管、標(biāo)準(zhǔn)管和空白管。在上述3支試管中加入鄰苯二甲醛試劑3 mL，濃硫酸2 mL，混勻，冷卻。用T-6紫外可見分光光度計(北京普析)以空白管調(diào)零，在560 nm處比色，計算蛋黃膽固醇含量[6]。

1.3.4 脂質(zhì)代謝

試驗結(jié)束時，每個重復(fù)中隨機(jī)選取1只雞，翅靜脈采血，以3 000 r/min離心10 min，分離血清，于-20 ℃保存。血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測定。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)差異采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 金銀花提取物對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

由表2可知，各試驗組的產(chǎn)蛋率、料蛋比和破軟蛋率與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。平均蛋重隨著金銀花提取物水平的增加呈先降低后升高的趨勢，100和200 mg/kg組的平均蛋重與對照組相比無顯著差異(P>0.05)，300 mg/kg組的平均蛋重與對照組相比顯著增加(P<0.05)。300 mg/kg組的平均日采食量與對照組相比顯著增加(P<0.05)。

2.2 金銀花提取物對蛋雞蛋品質(zhì)的影響

由表3可知，與對照組相比，各試驗組的蛋形指數(shù)、蛋黃顏色、蛋殼厚度、蛋殼強(qiáng)度均無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，各試驗組的哈氏單位均顯著提高(P<0.05)，100、200和300 mg/kg組分別提高了8.2%、6.2%和9.2%。

表2 金銀花提取物對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with the different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表3 金銀花提取物對蛋雞蛋品質(zhì)的影響

2.3 金銀花提取物對蛋雞脂質(zhì)代謝和蛋黃膽固醇含量的影響

由表4可知，與對照組相比，各試驗組的血清TG含量顯著降低(P<0.05)；各試驗組的血清TC含量顯著降低(P<0.05)，300 mg/kg組下降最明顯為27.56%。血清HDL-C含量隨金銀花提取物水平升高而升高，200、300 mg/kg組的血清HDL-C含量顯著高于對照組(P<0.05)。與對照組相比，各試驗組血清LDL-C含量無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，200和300 mg/kg組的蛋黃膽固醇含量顯著降低(P<0.05)，分別下降了8.17%和18.06%。

表4 金銀花提取物對蛋雞脂質(zhì)代謝和蛋黃膽固醇含量的影響

3 討 論

3.1 金銀花提取物對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

本試驗結(jié)果表明，飼糧中添加300 mg/kg的金銀花提取物可以顯著提高蛋雞平均日采食量和平均蛋重。金銀花提取物中的主要活性成分是CGA，CGA具有抗氧化性、抗菌、抗毒、提高免疫力等多種功能[7]。張瑞仙[8]研究顯示，在羅曼粉蛋雞飼糧中分別添加0.5%、1.0%、1.5%和2.0%金銀花，蛋雞的平均日采食量均分別提高了5.46%、8.20%、9.53%和9.63%，1.0%、1.5%和2.0%的添加量均顯著提高了產(chǎn)蛋率。黃濤等[9]在愛拔益加(AA)肉雞飼糧中添加0(對照)、0.05%、0.10%、0.15%和0.20%的杜仲葉CGA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.15%試驗組與對照組相比可以顯著提高7～14日齡和28～35日齡肉雞的平均日增重，0.05%和0.15%試驗組可分別降低28～35日齡肉雞料重比21.15%和19.34%。上述研究表明，CGA在改善動物生產(chǎn)性能方面具有積極作用。CGA改善動物生產(chǎn)性能可能是由于其具有較強(qiáng)的抗氧化能力，對脂質(zhì)過氧化抑制有積極作用[10]。關(guān)炳烽等[11]試驗表明，金銀花提取物抗氧化能力與CGA含量相關(guān)，且其清除羥基自由基的能力優(yōu)于維生素C。Zang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，CGA清除羥基的清除速率常數(shù)為7.73×109，認(rèn)為CGA的抗氧化性可能與直接清除羥基自由基有關(guān)。李文娜等[13]研究發(fā)現(xiàn)，CGA對超氧陰離子、羥基自由基、烷過氧自由基及1,1-二苯基-2-苦肼基等自由基有較強(qiáng)的清除作用，對烷過氧自由基、超氧陰離子的清除能力超過了維生素C。此外，CGA具有抗菌、抗病毒的能力，有助于提高家禽免疫力，從而改善生產(chǎn)性能。研究表明，CGA可以增強(qiáng)流感病毒抗原引發(fā)的T細(xì)胞增殖[14]，并且在大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)CGA可以顯著提高其體內(nèi)免疫球蛋白E(IgE)、免疫球蛋白G(IgG)和白細(xì)胞介素-4(IL-4)含量[15]。馬力等[16]研究表明，CGA可顯著提高大鼠腸道固有層淋巴細(xì)胞中γ腫瘤壞死因子和α干擾素含量。

3.2 金銀花提取物對蛋雞蛋品質(zhì)的影響

本試驗結(jié)果表明，試驗組蛋形指數(shù)、蛋黃顏色、蛋殼厚度、蛋殼強(qiáng)度與對照組相比均無顯著差異。各試驗組均顯著提高了雞蛋哈氏單位，說明金銀花提取物能夠提高蛋白高度，一定程度上有助于增強(qiáng)蛋白分泌。張瑞仙[8]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加0.5%和1.5%的金銀花粉可適當(dāng)提高雞蛋哈氏單位，但差異并不顯著。雞蛋蛋白的分泌主要是在輸卵管的膨大部分，金銀花提取物可能在此對分泌產(chǎn)生影響，由于其活性物質(zhì)CGA具有很好的抗氧化能力，有助于維持細(xì)胞膜的正常生理功能，這對分泌部位細(xì)胞膜可能具有積極作用，但其具體機(jī)制尚不完全清楚。邵洪等[17]認(rèn)為，自由基會對氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)等進(jìn)行修飾，促進(jìn)蛋白質(zhì)的降解，而金銀花提取物中含有的CGA對自由基有良好的清除作用。

3.3 金銀花提取物對蛋雞脂質(zhì)代謝和蛋黃膽固醇含量的影響

蛋雞體內(nèi)的膽固醇來源主要有2個途徑，第1個途徑是外源性的膽固醇(飼糧中的膽固醇)，由于蛋雞飼糧中通常不含膽固醇，所以這一途徑可忽略不計；第2個途徑是蛋雞自身合成，合成的主要部位是肝臟，在肝臟中合成蛋黃膽固醇的前體物質(zhì)是極低密度脂蛋白和卵黃蛋白原，合成的蛋黃膽固醇通過血液循環(huán)進(jìn)入卵巢沉積于蛋黃中[18]。蛋雞體內(nèi)的膽固醇主要通過3種方式排出，其一是通過雞蛋排出，這是最主要的方式，大概占膽固醇的2/3；其二是由肝臟和腸道產(chǎn)生中性固醇以糞便形式排出體外；其三是在肝臟中氧化的膽固醇形成膽汁酸通過糞便排出[19]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，200和300 mg/kg組蛋黃膽固醇含量與對照組相比分別下降了8.17%和18.06%。金銀花提取物中主要活性物質(zhì)CGA影響蛋雞脂肪代謝的原因可能有：1)通過影響膽固醇合成和分解的相關(guān)酶活性及相關(guān)基因表達(dá)來影響膽固醇水平。李文娜等[20]研究發(fā)現(xiàn)，杜仲葉CGA提取物抑制豬肝臟3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的效價強(qiáng)于辛伐他丁。HMG-CoA還原酶是膽固醇合成過程中的限速酶。Ong等[21]給口服葡萄糖耐量試驗后的db/db小鼠飼喂含250 mg/kg CGA的飼糧，發(fā)現(xiàn)CGA可以通過激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)來改善葡萄糖和脂質(zhì)代謝，從而影響AMPK-羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGR)通路。AMPK作用于HMGR肽鏈中Ser-871位點[22]。研究不同濃度5-氨基-4-咪唑羧基酰胺核苷(AICAR)對肝細(xì)胞HMGR活性影響時發(fā)現(xiàn)，隨著AICAR濃度增加，AMPK呈劑量依賴性活化的同時，HMGR呈劑量依賴性失活[23-24]。所以CGA可能通過激活A(yù)MPK，導(dǎo)致HMGR磷酸化失活，使膽固醇合成受到顯著抑制。膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)是肝臟合成并促使膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸的限速酶[25]。Wan等[26]通過對大鼠飼喂正常飼糧、高膽固醇飼糧以及在高膽固醇飼糧的基礎(chǔ)上添加CGA(1和10 mg/kg)的飼糧的研究，發(fā)現(xiàn)與正常飼糧組相比，飼糧添加CGA后，CYP7A1表達(dá)有所增加，促使膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸。2)通過調(diào)節(jié)膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBPs)影響膽固醇合成。Murase等[27]發(fā)現(xiàn)，在Hepal-6細(xì)胞中添加5 μmol/L CGA可以下調(diào)乙酰輔酶A羧化酶、脂肪酸合成酶和SREBP-1c等mRNA表達(dá)。3)通過增強(qiáng)過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)來提高內(nèi)源膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運，增強(qiáng)膽汁酸排泄。Li等[28]給雄性黃金倉鼠飼喂高脂飼糧(含脂肪15%)，之后對試驗組每天按每千克體重80 mg的劑量在腹腔注射含CGA的溶劑，8周后CGA顯著提高了倉鼠肝臟PPAR-αmRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。Fruchart等[29]認(rèn)為，PPARs的活化作用于與高密度脂蛋白(HDL)相關(guān)的5種基因，包括載脂蛋白A(apo-A)、載脂蛋白B(apo-B)、脂蛋白酯酶(LPL)、B族Ⅰ型清道夫受體(SR-BⅠ)和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1(ABCA1)，從而促進(jìn)HDL形成，提高血清中HDL含量，促進(jìn)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運的過程。本研究結(jié)果表明，金銀花提取物能顯著降低血清中TC和TG含量，且300 mg/kg組效果最好。200和300 mg/kg組均能提高血清HDL-C含量，促進(jìn)膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運過程。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加300 mg/kg金銀花提取物可以顯著提高蛋雞平均蛋重和平均日采食量，且對蛋雞生產(chǎn)性能無不良影響。

② 飼糧中添加金銀花提取物可以顯著提高雞蛋哈氏單位。

③ 飼糧中添加金銀花提取物可通過提高血清HDL-C含量，促進(jìn)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運，降低蛋黃膽固醇含量。

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*Corresponding author, associate professor, E-mail: marcli@126.com