吳建麗，韓 璐，劉旭東，王永亮，張淑香，杜冬梅，王天琪，梅榮軍*

（1．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)針灸研究所，哈爾濱 150040；2．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)院，哈爾濱 150001；3．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040）

人類(lèi)的睡眠和覺(jué)醒狀態(tài)是隨著晝夜周期的節(jié)律性而相互轉(zhuǎn)化的，良好的睡眠是促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)、恢復(fù)精力和體力的重要環(huán)節(jié)。隨著生活節(jié)奏的加快和工作競(jìng)爭(zhēng)壓力的增大，失眠的發(fā)病率不斷升高。調(diào)查表明，我國(guó)約有45.5%的人遭受失眠的困擾[1]。針刺被認(rèn)為是臨床治療失眠行之有效的非藥物療法之一，其對(duì)失眠后腦電睡眠結(jié)構(gòu)的修復(fù)及中樞神經(jīng)遞質(zhì)、體內(nèi)激素和肽類(lèi)物質(zhì)的內(nèi)在調(diào)節(jié)機(jī)制一直是臨床和科研工作者的重要研究課題。有實(shí)驗(yàn)研究表明針刺有促進(jìn)睡眠的作用，其機(jī)制可能通過(guò)延長(zhǎng)慢波和快動(dòng)眼睡眠時(shí)間、增加睡眠深度來(lái)改善睡眠[2-3]，同時(shí)針灸還可以調(diào)節(jié)褪黑素、生長(zhǎng)激素、皮質(zhì)酮、睡眠誘導(dǎo)肽等激素和肽類(lèi)活性發(fā)揮催眠作用，調(diào)整睡眠周期[4-5]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)PCPA法制備失眠大鼠模型，選用雙側(cè)項(xiàng)部腧穴結(jié)合不同頻率電針刺激干預(yù)失眠大鼠，觀察不同頻率電項(xiàng)針對(duì)失眠大鼠睡眠時(shí)相及血清ACTH、CORT含量的影響，探討電項(xiàng)針促眠的作用機(jī)制及不同刺激頻率電項(xiàng)針的療效差異。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)Wistar大鼠40只，雄性，9周齡，體質(zhì)量（230±20）g，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(黑)2013-001。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，室溫保持在22 ℃左右，所用實(shí)驗(yàn)大鼠的使用和喂養(yǎng)遵守動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)的規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器 4-氯-DL-苯基丙氨酸（Sigma公司進(jìn)口的分裝，Maya化學(xué)公司），水合氯醛（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司），大鼠ACTH、CORT ELISA試劑盒（南京建成生物研究所），VERSA max酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司），HHS21-6電熱恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），一次性針灸針（北京中研太和醫(yī)療器械有限公司），牙科204型南韓打磨機(jī)（哈爾濱市道外區(qū)新世紀(jì)科學(xué)器材商），MedLab-U/4C501H生物信號(hào)采集系統(tǒng)（南京美易科技有限公司），6805-AⅡ型電針儀（汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠有限公司）。

1.3 皮層電極埋置 參照文獻(xiàn)[6]埋置大鼠皮層腦電電極，10%水合氯醛腹腔注射深度麻醉大鼠（3 mL/100 g），用腦立體定位儀固定，剃除頭部毛發(fā)，碘伏消毒，剪開(kāi)頭部皮膚充分暴露顱骨，用30%的雙氧水去除顱骨表面的脂類(lèi)，充分暴露顱骨的冠狀縫和人字縫。用牙科打磨機(jī)分別在顱骨（AP-2，R2；AP+2，R2）鉆孔，用眼科鑷將2個(gè)直徑1 mm的眼鏡螺絲植入鉆孔內(nèi)，使之接觸不要刺穿硬腦膜，作為皮層電極；在額骨正中（AP+5，R0）鉆孔，放入眼鏡螺絲作為接地電極，記錄腦電波形。所有螺絲術(shù)前制成微型3孔子母插座，電極用502膠水固定在顱骨上，然后縫合皮膚切口，連續(xù)3 d腹腔注射4萬(wàn)U青霉素。術(shù)后單籠飼養(yǎng)，恢復(fù)7 d。

1.4 制備模型 埋置電極7 d后，除空白組外，采用PCPA腹腔注射法制備大鼠失眠模型[7]。造模前進(jìn)食水12 h，于每日上午9:00開(kāi)始抓取大鼠，在腹腔部緩慢注入PCPA混懸液，劑量為10 mL/kg，1次/d，連續(xù)2 d。28～30 h后模型形成。大鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失，對(duì)周?chē)曇簟⒐獯碳っ舾?，興奮性增高，表明造模成功。

1.5 分組及處理 將40只大鼠隨機(jī)分成空白組，模型組，電項(xiàng)針1組、電項(xiàng)針2組、電項(xiàng)針3組，每組8只?？瞻捉M：正常飲水進(jìn)食，自由活動(dòng)每日均抓取稱(chēng)重，固定四肢和軀干，保證同余下各組刺激相同，不做其他處理。模型組：造模前12 h禁食禁水，造模后恢復(fù)正常，每日稱(chēng)重和固定，保證相同刺激條件，不做其他處理。電項(xiàng)針Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組：造模前12 h禁食禁水，造模后恢復(fù)正常飲食，每日電項(xiàng)針針刺30 min，連續(xù)治療7 d。所有大鼠在造模前1周進(jìn)行埋置顱骨電極手術(shù)，在末次治療后描記腦電。

1.6 針刺治療方法 造模成功后第1天，除空白組和模型組，其余各組給予電項(xiàng)針治療，穴位選取大鼠項(xiàng)部雙側(cè)“風(fēng)池” 穴和“供血” 穴。用0.25 mm×25 mm一次性毫針，直刺7～10 mm，連接電子脈沖治療儀，導(dǎo)線(xiàn)分別上下連接同側(cè)針柄，刺激頻率電項(xiàng)針Ⅰ組為2 Hz、電項(xiàng)針2組為50 Hz、電項(xiàng)針3組為100 Hz，針刺30 min。取穴方法參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]。

1.7 指標(biāo)檢測(cè)

1.7.1 腦電采集與分析 正式描記腦電的前一天將3孔微型插座的子母端連接，對(duì)大鼠進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，持續(xù)時(shí)間3 h。末次治療后在電磁屏蔽室對(duì)所有大鼠進(jìn)行腦電描記，每只大鼠連續(xù)記錄腦電3 h。描記腦電前設(shè)置MedLab-U/4C501H生物信號(hào)采集系統(tǒng)參數(shù)，放大倍數(shù)200倍，上限頻率30 Hz，下限頻率2 s，采樣速度250 ms/div，勾選硬件50 Hz陷波，腦電清晰未見(jiàn)重疊。腦電分析采用目測(cè)法，以20 s為一分段單元進(jìn)行睡眠分析，如一單元存有2種以上睡眠期，則以主導(dǎo)分期判斷為這一單元性質(zhì)。根據(jù)大鼠腦電圖及有關(guān)文獻(xiàn)[9-10]標(biāo)準(zhǔn)，此睡眠周期包括覺(jué)醒期（wake，W）、慢波睡眠期（slow wave sleep，SWS）、快波睡眠期（fast wave sleep，F(xiàn)WS）3個(gè)睡眠時(shí)相，總睡眠時(shí)間（Total sleep time，TST）是SWS和FWS之和。

2 結(jié)果

2.1 電項(xiàng)針對(duì)大鼠睡眠時(shí)相的影響 從表1中可知，模型組大鼠SWS1、SWS2、FWS、TST各期時(shí)間與空白組比較均明顯減少，這表明制作失眠模型成功。各電項(xiàng)針治療組分別與模型組比較，其結(jié)果為：1）3個(gè)治療組對(duì)失眠大鼠SWS2、FWS、TST時(shí)間均有延長(zhǎng)作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），電項(xiàng)針1組和2組對(duì)SWS1期的增加具有極顯著性意義（P＜0.01）；2）3個(gè)不同刺激頻率治療組比較，結(jié)果顯示電項(xiàng)針1組對(duì)各期睡眠時(shí)間的延長(zhǎng)明顯優(yōu)于電項(xiàng)針2組和3組（P＜0.01）說(shuō)明電項(xiàng)針改善睡眠作用隨著刺激頻率的增加而減弱，低頻刺激促眠作用有優(yōu)于高頻刺激的趨勢(shì)，低頻電項(xiàng)針恢復(fù)失眠大鼠睡眠節(jié)律的作用最強(qiáng)。

2.2 電項(xiàng)針對(duì)大鼠血清ACTH、CORT含量的影響 與空白組相比，模型組大鼠血清中ACTH和CORT含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，各電項(xiàng)針治療組血清中ACTH和CORT含量均降低，其中電項(xiàng)針1組和2組與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。3個(gè)治療組之間比較，電項(xiàng)針1組ACTH和CORT含量改變優(yōu)于電項(xiàng)針2和3組（P＜0.01，P＜0.05）。（見(jiàn)圖1-2）

1.7.2 血清ACTH、CORT含量的測(cè)定 各組描記腦電后，用10%水合氯醛腹腔麻醉，剪開(kāi)腹部皮膚，迅速找到腹主動(dòng)脈采血3～5 mL，置于離心管內(nèi)，靜止20 min后，在低溫離心機(jī)上以3 000 r/min的速度離心10 min，取上清也置于EP內(nèi)，在-20 ℃冰箱保存待測(cè)。應(yīng)用ELISA方法在VERSA max酶標(biāo)儀上測(cè)定血清內(nèi)ACTH、CORT的含量，試劑盒由南京建成生物研究所提供，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。

表1 不同頻率電項(xiàng)針對(duì)大鼠腦電圖睡眠時(shí)相的影響（x± s ，n = 8）

圖1 各組大鼠血清中ACTH含量比較（x± s，8只大鼠/組）

圖2 各組大鼠血清中CORT含量比較（x± s，8只大鼠/組）

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，失眠是由于大腦皮層的興奮與抑制功能失調(diào)而引起的以睡眠始發(fā)和睡眠維持障礙為臨床表現(xiàn)的一組疾病[11-12]。研究表明，失眠是導(dǎo)致內(nèi)源性應(yīng)激反應(yīng)的一種重要因素，它能強(qiáng)烈興奮下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸）影響體內(nèi)多種激素的水平，引起機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)功能發(fā)生紊亂從而產(chǎn)生諸多病癥[13-15]。西醫(yī)多采用苯二氮卓類(lèi)藥物抑制大腦興奮性來(lái)治療失眠，但長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)出現(xiàn)成癮性、耐藥性、依賴(lài)性及反跳性失眠等不良反應(yīng)[16-17]。

電項(xiàng)針療法是高維濱教授利用多年臨床經(jīng)驗(yàn)結(jié)合現(xiàn)代解剖學(xué)理論創(chuàng)立治療腦源性疾病的新方法。高教授在仔細(xì)研究了項(xiàng)部“風(fēng)池”和“供血”穴的解剖結(jié)構(gòu)后，發(fā)現(xiàn)二穴下有與睡眠-覺(jué)醒密切相關(guān)的腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)針刺二穴并給予電流刺激，通過(guò)腦干上行激活系統(tǒng)使大腦皮層興奮性增強(qiáng)，恢復(fù)興奮與抑制過(guò)程的平衡，改善失眠狀態(tài)，調(diào)整覺(jué)醒-睡眠周期[18-19]。

研究表明，腦電波是判斷睡眠深度、反映睡眠各階段特征變化的一種有效手段，能客觀的記錄實(shí)際睡眠維持時(shí)間、睡眠效率、睡覺(jué)結(jié)構(gòu)等客觀指標(biāo)[20]。本實(shí)驗(yàn)利用生物信號(hào)采集系統(tǒng)描記大鼠的睡眠腦電，分別觀察了正常大鼠、造模后大鼠及3種不同頻率治療組大鼠的腦電變化，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCPA致失眠大鼠TST明顯減少，各頻率針刺組均能通過(guò)延長(zhǎng)失眠大鼠SWS1、SWS2和FWS期來(lái)延長(zhǎng)TST，并且調(diào)整睡眠各期的比例與正常大鼠相近，提示電項(xiàng)針對(duì)失眠大鼠的睡眠有改善作用；同時(shí)發(fā)現(xiàn)2 Hz頻率刺激組對(duì)各期睡眠時(shí)間的延長(zhǎng)明顯優(yōu)于50 Hz和100 Hz，提示電項(xiàng)針促眠作用隨著刺激頻率的增加而降低，低頻刺激恢復(fù)失眠大鼠睡眠節(jié)律的作用最強(qiáng)。

睡眠是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自我調(diào)節(jié)過(guò)程，與機(jī)體內(nèi)分泌激素之間存在明顯的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)[21]，HPA軸激活可以促進(jìn)ACTH、CORT的合成和分泌，提高大腦皮層應(yīng)激性并維持覺(jué)醒狀態(tài)，這是引起失眠的重要原因。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠血清ACTH、CORT含量明顯增多，說(shuō)明造模后，影響了血清激素的分泌，是大鼠失眠的原因之一。經(jīng)過(guò)電項(xiàng)針治療后，3個(gè)治療組大鼠血清ACTH、CORT的含量均較模型組減少，說(shuō)明電項(xiàng)針能抑制HPA的興奮，促進(jìn)睡眠。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較2 Hz、50 Hz及100 Hz電項(xiàng)針刺激療效，發(fā)現(xiàn)2 Hz治療組大鼠血清ACTH、CORT含量降低的更為明顯，說(shuō)明不同的刺激頻率治療失眠具有不同的效應(yīng)差異，低頻電項(xiàng)針對(duì)睡眠的調(diào)節(jié)作用最好。

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