周文斯，熊犍，鄭雪君，陳智光，王海萍，崔春*

(1.華南理工大學 食品科學與工程學院，廣州 510640；2.廣東真美食品股份有限公司，廣東 潮州 515637)

高濃技術(shù)是指在發(fā)酵或酶解過程中通過提高底物濃度、降低體系水分含量，從而提高單位設(shè)備生產(chǎn)效率、節(jié)約資源能源的一種新型綠色技術(shù)[1]。高濃蛋白酶解技術(shù)具有許多優(yōu)點：顯著提高了生產(chǎn)設(shè)備利用率，提升了單位設(shè)備的產(chǎn)能；單位產(chǎn)品產(chǎn)生廢水更少，廢水治理成本低；酶解產(chǎn)物的濃縮、干燥所耗能量更低。以生產(chǎn)水解度為4.5%的改性小麥面筋蛋白為例，當酶解體系的固形物濃度從10%提高到40%時，單位重量改性面筋蛋白所需水的消耗和濃縮能耗分別降低6倍和5.97倍，單位體積酶解罐的產(chǎn)能提高3.97倍[2]。因此，高濃蛋白酶解技術(shù)在食品工業(yè)中有著廣泛的應用前景。本文將酶解液中固形物濃度超過20%或以上稱為高濃體系。

然而，高濃蛋白酶解體系中，不溶性酶解殘渣占酶解體系的比例顯著增加，常規(guī)的離心或稀釋處理可能導致水解度和蛋白回收率測定產(chǎn)生較大誤差。此外，高濃蛋白酶解體系中蛋白質(zhì)的溶解度和聚集狀態(tài)發(fā)生較大變化[3，4]，其酶切位點和酶解工藝可能與常濃蛋白酶解體系有較大差異。

因此，本實驗擬以大豆分離蛋白為原料，優(yōu)化了高濃蛋白酶解體系中水解度和蛋白回收率的測定方法，并通過酶種類、pH、溫度和加酶量單因素試驗，結(jié)合感官評價，對高濃大豆分離蛋白酶解工藝進行優(yōu)化，以期為高濃大豆蛋白酶解的產(chǎn)業(yè)化提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

1.1.1.1 材料

大豆分離蛋白 山東香馳豆業(yè)科技有限公司；氫氧化鈉(分析純) 天津市明亮化學試劑廠；鹽酸(分析純) 廣東省東紅化工廠；硼酸(分析純) 天津市福晨化學試劑廠；硫酸(分析純) 江蘇強盛功能化學股份有限公司；甲醛(分析純) 廣東光華化學有限公司；硫酸鉀、溴甲酚綠、甲基紅(分析純) 廣州市金華大化學試劑有限公司。

1.1.1.2 酶制劑

復合蛋白酶(食品級)、堿性蛋白酶(食品級)、風味蛋白酶(食品級) 北京諾維信酶制劑公司；中性蛋白酶(食品級) 杰能科生物工程有限公司；酸性蛋白酶(PR23食品級) 廣東裕力寶酶制劑公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

PHS-3E數(shù)顯pH計 上海精密科學儀器有限公司；GL-21M高速冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司；101A-2數(shù)顯電熱鼓風干燥箱 上海浦東躍欣科學儀器廠；Sartotius BP211D分析天平 中科院廣州化學研究院；KND-2C定氮儀、KDN-40消化爐 上海纖檢儀器有限公司；THZ-82A 水浴恒溫振蕩器 金壇市華城開元實驗儀器廠；磁力攪拌器 國華電器有限公司。

1.2 檢測與分析方法

1.2.1 水解度的測定方法

配制pH為3.5的大豆分離蛋白溶液100 g，濃度分別為8%，16%，24%，32%，添加底物質(zhì)量1%的酸性蛋白酶(PR23)，磁力攪拌均勻。在55 ℃下分別酶解8，18，48 h，沸水浴20 min滅酶。酶解物的總氮含量為TN，采用以下4種預處理方法并測定水解度：

直接測定酶解物的氨基酸態(tài)氮含量AN1；分別將濃度為16%，24%，32%的酶解物稀釋到8%，測定稀釋后酶解物的氨基酸態(tài)氮含量AN2；酶解物經(jīng)6000 g離心15 min，過濾后獲得上清液，測定上清液的氨基酸態(tài)氮含量AN3；分別將濃度為16%，24%，32%的酶解物稀釋到8%，6000 g離心15 min，過濾后獲得上清液，測定上清液的氨基酸態(tài)氮含量AN4。水解度的測定參考Cui等的方法[5]，總氮含量的測定采用凱氏定氮法(參照GB 5009.5-2010)，氨基酸態(tài)氮含量的測定采用甲醛滴定法。

1.2.2 蛋白回收率的測定方法

同1.2.1的方法，配制pH為3.5，不同濃度不同酶解時間的大豆分離蛋白溶液。原料總蛋白含量為M，采用以下2種預處理方法并測定蛋白回收率：

酶解物經(jīng)離心、過濾后獲得上清液，測定上清液的總蛋白含量為M1=上清液總氮×上清液質(zhì)量；

分別將濃度為16%，24%，32%的酶解物稀釋到8%，離心、過濾后獲得上清液，測定上清液的總蛋白含量為M2=上清液總氮×上清液質(zhì)量。

參考賈愛娟[6]的方法并稍做修改。采用凱氏定氮法分別測定上清液和原料中蛋白質(zhì)的含量。

1.3 高固形物濃度酶解工藝優(yōu)化

1.3.1 高固形物濃度酶解工藝中酶的篩選

配制底物濃度為32%，質(zhì)量為100 g的大豆分離蛋白溶液5份。選取5種商業(yè)蛋白酶，分別調(diào)節(jié)pH和溫度至各種酶的最適條件(風味蛋白酶、復合蛋白酶和中性蛋白酶的最適條件為50 ℃，pH 7.0，酶解時間8 h，加酶量1%；堿性蛋白酶的最適條件為55 ℃，pH 8.0，酶解時間8 h，加酶量1%；酸性蛋白酶(PR23)的最適條件為55 ℃，pH 3.5，酶解時間8 h，加酶量1%)，磁力攪拌均勻后酶解8 h，沸水浴20 min滅酶，分別稀釋至濃度為8%，測定其水解度和蛋白回收率。

1.3.2 高固形物濃度酶解工藝中pH、溫度和加酶量的確定

配制底物濃度為32%，質(zhì)量為100 g的大豆分離蛋白溶液10份，分別在pH為2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0條件下(溫度為55 ℃，加酶量為底物重量的1%)；在40，45，50，55，60 ℃條件下(pH 3.5，加酶量為底物重量的1%)；分別添加底物質(zhì)量0.2%，0.5%，1%，1.5%，2%的商業(yè)蛋白酶(溫度為55 ℃)；磁力攪拌均勻后酶解8 h，沸水浴20 min滅酶，分別稀釋至濃度為8%，測定其水解度和蛋白回收率。

1.3.3 最優(yōu)酶解工藝制備大豆鮮味基料的感官評價

感官評價法是對呈味物質(zhì)分析最常用的方法[7]。本實驗使用定量描述分析(QDA)方法，在(23±2) ℃的感官評定室進行評定。采用兩種配方，分別是0.1%酶解物直接評價和0.1%酶解物+0.3%食鹽調(diào)配，用飲用水配制成100 mL溶液。每個樣品溶液取10 mL盛放在杯中，鑒評員將溶液全部浸入口中，并保持10 s左右的時間，然后吐出。感官評價使用線性圖形標度，0～9分制(無感覺-閾值感覺-微弱-中等-強烈)，定量描述分析結(jié)果用雷達圖表示[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高固形物濃度酶解體系中水解度和蛋白回收率預處理方法的建立

水解度(degree of hydrolysis, DH)是指蛋白質(zhì)分子在水解過程中被斷裂的肽鍵數(shù)和原料中總肽鍵數(shù)的百分比[9]。在蛋白質(zhì)水解度的測定上，國際上普遍采用的預處理方法是離心或過濾處理[10，11]。

本實驗將濃度為8%，16%，24%，32%的大豆分離蛋白溶液分別進行8 h(輕度)，18 h(中度)，48 h(深度)不同程度的酶解，采用4種不同預處理方法處理大豆蛋白水解物并測定酶解物的水解度，結(jié)果見圖1。

圖1 預處理方法對不同濃度大豆蛋白酶解液的水解度的影響Fig.1 Influence of different pretreatments on DH of SPI for different concentration

注：DH分別隨酶解時間8 h(a)，18 h(b)，48 h(c)的變化趨勢。

由圖1(a，b，c)可知，隨著酶解時間的延長，大豆蛋白的水解度越高。在水解度的測定方面，不離心直接測定和稀釋到8%測定酶解物水解度的結(jié)果基本一致，而采用離心處理后水解度顯著降低，且固形物濃度越高，離心預處理造成的誤差越大。推測是由于固形物濃度較高時，酶解物離心后殘留渣較多，而殘渣中保留一部分游離氨基酸和寡肽導致測定結(jié)果偏低。而稀釋后離心處理可有效降低殘留在殘渣中氨氮含量，從而縮小測定值差距。上述結(jié)果表明：離心處理后所測的不同濃度下蛋白水解度不能反映其真實水解效果，因此本實驗選取不離心直接測酶解物的方法作為高濃酶解物水解度測定的預處理方法。

采用兩種不同預處理方法處理大豆蛋白水解物并測定酶解物的蛋白回收率，結(jié)果見圖2。

圖2 預處理方法對不同濃度大豆蛋白酶解液的蛋白回收率的影響Fig.2 Influence of different pretreatments on protein recovery of SPI for different concentration

蛋白回收率表示原料中的蛋白質(zhì)經(jīng)生物酶分解作用后，酶解液上清液中的蛋白總量占原料中的蛋白總量的百分比，即原料中的蛋白質(zhì)被分解回收的程度。由圖2可知，直接離心測定的蛋白質(zhì)回收率測定結(jié)果偏低，而稀釋到8%再離心測定的蛋白回收率更接近準確值。這是由于固形物濃度較高時，蛋白質(zhì)分子容易發(fā)生聚集反應，因此降低了可溶蛋白質(zhì)含量。因此，本實驗選取稀釋到8%再離心酶解物的方法作為高濃酶解物蛋白回收率測定的預處理方法。經(jīng)相關(guān)性分析，水解度(直接測定)和蛋白回收率(稀釋離心)的相關(guān)系數(shù)r=0.773，相關(guān)性極顯著(P<0.01)，兩個指標存在很強的相關(guān)性。在相同水解條件下，水解度越高，蛋白回收率越高。

2.2 高固形物濃度酶解工藝的優(yōu)化

以大豆分離蛋白為原料，以水解度和蛋白回收率為指標，通過酶種類、pH、溫度和加酶量單因素試驗，結(jié)合感官評價，對高濃大豆分離蛋白酶解工藝進行優(yōu)化。

2.2.1 不同商業(yè)蛋白酶對高濃大豆分離蛋白酶解效率的影響

大豆分離蛋白經(jīng)控制酶解后可產(chǎn)生氨基酸和呈味肽，一般經(jīng)驗表明，水解度越高，大豆蛋白酶解物的呈味強度越高。本試驗對各種商業(yè)蛋白酶的水解效率進行了評價，從而篩選出適用大豆蛋白水解的最佳酶制劑。不同商業(yè)蛋白酶對高濃大豆分離蛋白溶液水解的效果見圖3。

圖3 不同商業(yè)蛋白酶對高濃大豆分離蛋白溶液水解效率的影響Fig.3 Influence of different proteases on hydrolysis degree of high-concentration SPI

由圖3可知，5種商業(yè)蛋白酶對高濃大豆分離蛋白溶液均產(chǎn)生了不同程度的水解，其中酸性蛋白酶(PR23)、堿性蛋白酶、風味酶的效果較為明顯，其中酸性蛋白酶(PR23)水解度最高，風味酶次之，分別達到12.98%和10.24%，其他3種酶均低于8%。堿性蛋白酶蛋白回收率最高，酸性蛋白酶(PR23)和風味蛋白酶次之，分別達到52.97%，50.28%和50.27%，其他兩種酶均低于50%。綜合考慮水解度和蛋白回收率這兩個指標，選擇酸性蛋白酶(PR23)進一步研究。

2.2.2 不同pH對高濃大豆分離蛋白酶解效率的影響

不同pH酸性蛋白酶(PR23)對高濃大豆分離蛋白酶解的影響見圖4。

圖4 不同pH值對酸性蛋白酶(PR23)酶解高濃大豆分離蛋白的影響Fig.4 Influence of different pH on hydrolysis degree of high-concentration SPI enzymatic hydrolyzed by acid protease(PR23)

pH是影響蛋白體系酶解效率的重要因素之一，影響酶分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和底物的解離，從而影響酶解效率[12，13]。由圖4可知，當pH從2.5上升到3.5時，水解度和蛋白回收率隨之增大，當pH繼續(xù)升高時，兩指標反而下降。蛋白體系pH為3.5時，水解度和蛋白回收率分別達到13.00%和50.45%，為酸性蛋白酶(PR23)的最適pH值。

2.2.3 不同溫度對高濃大豆分離蛋白酶解效率的影響

不同溫度酸性蛋白酶(PR23)對高濃大豆分離蛋白酶解的影響見圖5。

圖5 不同溫度對酸性蛋白酶(PR23)酶解高濃大豆分離蛋白的影響Fig.5 Influence of different temperatures on hydrolysis degree of high-concentration SPI enzymatic hydrolyzed by acid protease(PR23)

蛋白酶作用都有一個最適溫度范圍，溫度過低不利于酶解，溫度過高酶失活。由圖5可知，當反應溫度從40 ℃上升到55 ℃時，水解度和蛋白回收率隨之增大，當溫度繼續(xù)升高時，兩指標反而下降。蛋白體系反應溫度為55 ℃時，水解度和蛋白回收率分別達到13.01%和54.71%，為酸性蛋白酶(PR23)的最適反應溫度。

2.2.4 不同加酶量對高濃大豆分離蛋白酶解效率的影響

不同酶用量酸性蛋白酶(PR23)對高濃大豆分離蛋白酶解的影響見圖6。

圖6 不同加酶量對酸性蛋白酶(PR23)酶解高濃大豆分離蛋白的影響Fig.6 Influence of different protease amount on hydrolysis degree of high-concentration SPI enzymatic hydrolyzed by acid protease(PR23)

在酶解反應過程中，當酶濃度較低時，體系反應速度隨著酶濃度的升高而加快，但當酶達到一定濃度時，酶自身相互水解限制了酶對底物的水解作用。由圖6可知，隨著酶用量的增加，水解度和蛋白回收率不斷增大。工業(yè)生產(chǎn)的過程中，除了考慮酶解效率外，還需要考慮生產(chǎn)成本。因此，綜合考慮，選擇1%作為最適酶用量，水解度和蛋白回收率分別達到13.08%和51.13%。

2.2.5 大豆蛋白高濃酶解產(chǎn)物的感官評價

圖7 兩種配方高濃大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物感官對比Fig.7 Comparison of two formula of SPI concentrated enzymatic hydrolysates on sensory quality results

由圖7可知，兩種配方高濃大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物的感官評分相對差別較大。0.1%酶解物直接評價鮮味評分均為5.0，苦味評分均為5.0，酸味評分均為2.0，厚味評分均為4.0，咸味評分均為5.0；而0.1%酶解物+0.3%食鹽調(diào)配的鮮味評分均為6.0，苦味評分均為3.0，酸味評分均為1.5，厚味評分均為6.0，咸味評分均為5.0。這表明添加食鹽可顯著地降低大豆蛋白酶解物的苦味，增強其鮮味和厚味。

3 結(jié)論

在高濃蛋白酶解體系中，水解度測定采用不離心直接測酶解物的預處理方法，蛋白回收率測定采用稀釋離心的預處理方法較能反映真實水解效果。選擇酸性蛋白酶(PR23)在pH 3.0，溫度55 ℃，加酶量1%條件下，酶解8 h，水解度和蛋白回收率分別達到13.08%和51.13%；同時感官評價結(jié)果表明；0.1%高濃蛋白酶解物與3%食鹽進行調(diào)配，顯著降低了苦味，增強了鮮味和厚味。本文可為高濃大豆分離蛋白酶解制備鮮味基料的產(chǎn)業(yè)化提供理論指導。

[1]Xue Y,Jameel H,Phillips R,et al.Split addition of enzymes in enzymatic hydrolysis at high solids concentration to increase sugar concentration for bioethanol production[J].Journal of Industrial and Engineering Chemistry,2012,18(2):707-714.

[2]Hardt N A,Goot A J,Boom R M.Influence of high solid concentrations on enzymatic wheat gluten hydrolysis and resulting functional properties[J].Journal of Cereal Science,2013,57(3):531-536.

[3]O' Loughlin I B,Murray B A,Brodkorb A,et al.Whey protein isolate polydispersity affects enzymatic hydrolysis outcomes[J].Food Chemistry,2013,141(3):2334-2342.

[4]McPhie P,Ni Y,Minton A P.Macromolecular crowding stabilizes the molten globule form of apomyoglobin with respect to both cold and heat unfolding[J].Journal of Molecular Biology,2006,361(1):7-10.

[5]Cui C,Hu Q,Ren J,et al.Effect of the structural features of hydrochloric acid-deamidated wheat gluten on its susceptibility to enzymatic hydrolysis[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2013,61(24):5706-5714.

[6]賈愛娟.提高高鹽稀態(tài)法釀造醬油原料蛋白質(zhì)利用率及氨基酸出品率的研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學,2006.

[7]付娜,王錫昌.滋味物質(zhì)間相互作用的研究進展[J].食品科學,2014,35(3):269-275.

[8]馬永強,韓春然,劉靜波.食品感官檢驗[M].北京:化學工業(yè)出版社,2007.

[9]徐英操,劉春紅.蛋白質(zhì)水解度測定方法綜述[J].食品研究與開發(fā),2007,28(7):173-176.

[10]Babini E,Tagliazucchi D,Martini S,et al.LC-ESI-QTOF-MS identification of novel antioxidant peptides obtained by enzymatic and microbial hydrolysis of vegetable proteins[J].Food Chemistry,2017,228:186.

[12]Cavallieri A L F,Da Cunha R L.The effects of acidification rate,pH and ageing time on the acidic cold set gelation of whey proteins[J].Food Hydrocolloids,2008,22(3):439-448.

[13]Machado F F,Coimbra J S R,Rojas E E G,et al.Solubility and density of egg white proteins: effect of pH and saline concentration[J].LWT-Food Science and Technology,2007,40(7):1304-1307.