朱漫漫 余玉明 劉艷君

(南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院免疫學教研室,廣州 510515)

正常情況下，機體識別自身組織成分不對其產(chǎn)生免疫應答，或僅產(chǎn)生輕微的免疫應答，此為免疫耐受。在某些異常情況下(如病毒感染、體細胞基因突變)，自身耐受遭到破壞，導致機體免疫系統(tǒng)對自身抗原產(chǎn)生免疫應答，誘生自身抗體和(或)自身致敏淋巴細胞，此即自身免疫。若自身免疫應答過強或持續(xù)時間過久，以致對表達自身靶抗原的細胞和組織發(fā)動攻擊，導致?lián)p傷或功能障礙并出現(xiàn)相應臨床癥狀時，就稱為自身免疫病。到目前為止，自身免疫病已成為第三大引起人類死亡的主要疾病[1]。自身免疫病的傳統(tǒng)治療方案主要是免疫抑制療法，其雖有利于緩解免疫細胞對自身組織的損傷，但仍存在著較多的副作用(如機會致病菌的感染以及惡性腫瘤等)，更重要的是對于大多數(shù)患者而言，它的臨床治療效果并不顯著[2,3]。因此，在最近的幾十年，越來越多的研究者將目光轉(zhuǎn)向于針對自身抗原、過敏原特異性的免疫耐受誘導方案，而ECDI修飾的同基因型脾細胞偶聯(lián)抗原(Ag-SPs)誘導的免疫耐受是近幾年出現(xiàn)的極具前景的誘導耐受方案。

1 自身免疫病的傳統(tǒng)治療方案

1.1免疫抑制療法

1.1.1非特異性免疫抑制療法 主要是指廣譜的免疫抑制劑，曾是治療自身免疫病最主要的方法。非特異性免疫抑制劑通過刪除或滅活全部的T/B淋巴細胞亞群，選擇性地抑制抗原的遞呈、促炎性細胞因子的產(chǎn)生以及淋巴細胞的遷移，從而從整體上控制了自身淋巴細胞對自身抗原的免疫應答[4,5]。但其非特異性抑制作用可導致機體免疫功能低下，從而使機會致病菌感染的風險增加。另外，非特異性免疫抑制劑對機體具有潛在的毒性作用[6]。

1.1.2特異性免疫抑制療法 (1)特異性抑制T細胞療法：現(xiàn)普遍認為絕大多數(shù)自身免疫病是由于免疫耐受遭到破壞，免疫調(diào)節(jié)能力和抗原自身反應之間失衡，導致自身的T淋巴細胞，尤其是CD4+T細胞對自身抗原發(fā)生免疫應答，從而破壞自身正常組織結構并引起相應臨床癥狀[7]。因此特異性地阻斷自身反應性T細胞的應答，被認為是最有希望誘導抗原特異性耐受的方法。傳統(tǒng)的特異性抑制T細胞療法包括：溶解性肽療法、變構肽、共刺激阻斷、CD3抗體等[1,8]，然而這些方法大部分不能成功，或者只對部分患者有效。(2)特異性抑制B細胞療法：在非肥胖型糖尿病(Non-obese diabetic ，NOD)動物模型以及人類Ⅰ型糖尿病(T1D)的發(fā)病機理中，B細胞最開始并不被認為是一個關鍵的致病因素[9]。直到有研究者在NOD小鼠中發(fā)現(xiàn)它的消融作用(Ablation)以及對自身抗原的遞呈作用而最終被證實[10,11]。后來，Luan等[12]將NOD小鼠血清中帶有致病性的自身抗體收集純化后作為抗原免疫BALB/c小鼠，再將免疫后產(chǎn)生的抗體注射到NOD小鼠體內(nèi)，他們發(fā)現(xiàn)這種抗體可殺傷與自身抗體分泌、遞呈相關的B細胞系，從而減輕胰島炎癥狀，最終延緩NOD小鼠糖尿病的發(fā)生[12]。

1.2替代療法 有些自身免疫介導的損傷具有器官特異性，如T1D是由于自身反應性免疫細胞集聚并選擇性地破壞胰腺β細胞[13]，因此這些自身免疫病可通過修復或替代損害的細胞或組織進行治療，這種治療方法就稱為替代療法。替代療法，尤其是激素替代療法，對早期某些自身免疫病(如T1D、甲狀腺炎等)具有顯著的療效[1]。以T1D為例，其傳統(tǒng)的治療方案主要以胰島素替代治療為主。但這種治療方法需要反復皮下注射，并且會出現(xiàn)酮癥酸中毒、低血糖反應以及多器官衰竭等嚴重并發(fā)癥[11]。

1.3其他 (1)抗原肽的直接遞呈：最早在1920年Sulzberger[14]就提出并證實：以靜脈注射的方式將抗原肽直接傳遞給宿主，能夠在宿主體內(nèi)誘導出抗原特異性的T細胞無能。后來Chiller等[15]同樣證實溶解性抗原蛋白的直接呈遞可有效地誘導宿主外周T細胞耐受[3]。然而，致命性致敏的發(fā)生限制了其實際的臨床應用[16]。(2)造血干細胞移植：是重建正常造血和免疫功能的一種有效手段，主要用于治療多種血液系統(tǒng)相關疾病[17]。近年來有研究者將其用于復發(fā)-緩解型多發(fā)性硬化癥(RRMS)的治療，但臨床研究表明：自體造血干細胞移植(aHSCT)效果并不顯著，并且難以獲得足夠數(shù)量的、穩(wěn)定的、特異性的干細胞[8]。

2 ECDI在自身免疫病中的應用

ECDI即1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺[1-ethyl-3-(3′-dimethylaminopropyl)-carbodiimide]，是一種易潮濕、水溶性的化學藥物，含有N=C=N官能團，其首先與肽鏈上游離的羧基反應形成活化酯中間體，再與游離的氨基反應，能夠加速羧基與氨基之間酰胺鍵的形成，從而廣泛應用于偶聯(lián)反應和肽的合成[18]。1966年時Johnson等[19]在間接血凝實驗中發(fā)現(xiàn)：ECDI可以將牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)到兔紅細胞上。后來Wetzig等[20]在其研究中進一步證實：ECDI作為一種有效的偶聯(lián)劑可穩(wěn)定地將卵清蛋白(OVA)與小鼠脾細胞偶聯(lián)?；谇叭说难芯?，最近有研究者將ECDI應用于自身免疫病和器官移植模型中，并證實了ECDI修飾的同基因型脾細胞偶聯(lián)抗原(Ag-SPs)或ECDI修飾的同種異體/異種脾細胞(ECDI-SPs)，可以成功地在宿主體內(nèi)誘導出抗原特異性的免疫耐受，在預防和治療Th1/17介導的自身免疫病[8]、Th2介導的過敏性疾病[21]，同種/異種細胞移植[22,23]以及同種器官移植中[24]，Ag-SPs/ECDI-SPs所誘導的免疫耐受均取得了顯著療效，并且這種誘導耐受方案目前已在多發(fā)性硬化癥(MS)患者上進行臨床Ⅰ/ⅡA期試驗[25]。本文對ECDI在三種常見自身免疫病中的應用進行綜述。

2.1多發(fā)性硬化癥 多發(fā)性硬化癥(Multiple sclerosis，MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘為特點、由CD4+T細胞對髓鞘抗原自身應答所介導的自身免疫病[26]。

實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)是人類MS應用最廣泛，同時也是最經(jīng)典的動物模型，因此常將小鼠的EAE模型用于人類MS的發(fā)病機理研究、治療以及預防等。Smith等[27]在其實驗中選用了4種致腦炎性髓鞘抗原肽(PLP139-151、PLP178-191、MBP84-104和MOG92-106)免疫SJL小鼠制備EAE動物模型。他應用ECDI將這4種抗原肽分別或者混合與小鼠的脾細胞偶聯(lián)(Ag-SPs)，預先7 d將Ag-SPs靜脈注射到小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，無論是在單個還是混合髓鞘肽免疫的EAE模型中，Ag-SPs都能有效預防臨床EAE的發(fā)生。研究者認為Ag-SPs主要通過抑制外周特異性T細胞的記憶應答，降低促炎性細胞因子IL-2、IFN-γ的水平以及炎性細胞對脊髓的浸潤等機制，極大降低了腦脊髓炎的發(fā)病率。接下來研究者在用PLP139-151或PLP178-191免疫的復發(fā)型EAE(R-EAE)模型中，用同樣的處理方法，發(fā)現(xiàn)Ag-SPs仍然能夠明顯改善EAE的復發(fā)[28]。因此研究者認為，在EAE動物實驗模型中，相對于傳統(tǒng)治療方法而言，Ag-SPs是一種更有效預防EAE發(fā)生、改善R-EAE復發(fā)的誘導耐受方法。其他研究者Turley等[29]也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。在單用PLP139-151制備的EAE模型中，他們應用上述的處理方法觀察到，Ag-SPs能夠特異性抑制致病性T細胞的應答，預防EAE的發(fā)生。

2.2Ⅰ型糖尿病 Ⅰ型糖尿病(Type 1 diabetes，T1D)是由自身反應性CD4+和CD8+T細胞集聚并選擇性地破壞胰腺β細胞所導致的一種慢性免疫性疾病[11]。在T1D動物模型制備中，NOD小鼠是最常用的一種小鼠品系[30]。

Prasad等[13]在NOD小鼠模型中，選用了多種T1D自身抗原：胰島素(Ins B9-23、Ins B15-23)，IGRP(IGRP205-214)和GAD65(GAD65509-524、GAD65524-543)，應用ECDI將這些自身抗原偶聯(lián)到小鼠SPs上，在幼齡小鼠未發(fā)病前(4～5周)靜脈注射到小鼠體內(nèi)，繼而觀察其發(fā)病情況。他們發(fā)現(xiàn)，Ins-SPs，尤其是Ins B9-23-SPs能夠明顯降低T1D的發(fā)生率，抑制IFN-γ的分泌，減少免疫細胞對胰腺胰島細胞的浸潤，從而對年幼的小鼠起到保護作用。

為了更好地研究Ag-SPs對人類T1D的治療療效，Niens等[31]人引用了一種人源化T1D小鼠-NOD.β2mnull.HHD。他們用ECDI將小鼠SPs與多肽混合物偶聯(lián)(INS+IGRP)或與單個抗原(INS/IGRP)偶聯(lián)，仍然在小鼠未發(fā)病(4～6周)時給予靜脈處理。他們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，INS/IGRP-SPs能明顯降低糖尿病的發(fā)病率，并進一步明確主要是IGRP-SPs在其中發(fā)揮了關鍵的保護作用。IGRP-SPs通過降低CD8+T細胞對IGRP特異性的應答，抑制IFN-α的分泌等機制抑制了糖尿病的發(fā)生發(fā)展[32]。這些結果均表明，無論在NOD小鼠，還是在人源化NOD.β2mnull.HHD 模型中，Ag-SPs都能特異性誘導出有效的、穩(wěn)定的自身免疫耐受，從而保護幼鼠，避免T1D的發(fā)生[32]。

2.3過敏性疾病 過敏性哮喘是由嗜酸性粒細胞和T淋巴細胞參與的慢性氣道炎癥性疾病，而食物過敏是由肥大細胞介導的消化系統(tǒng)內(nèi)或全身性的免疫反應性疾病[33]，它們都屬于由Th2型細胞介導的免疫性疾病。

Smarr等[21]在其實驗體系中用了兩個過敏癥模型：卵清蛋白(OVA)誘導的過敏性氣道炎癥模型以及花生提取物(WPE)誘導的食物過敏模型。在過敏性氣道炎癥模型中，他們觀察了OVA-SPs對局部炎癥的控制情況，在第28天連續(xù)3 d給予霧化OVA吸入后，對支氣管肺泡灌洗液分析發(fā)現(xiàn)，OVA-SPs處理的小鼠肺部嗜酸性粒細胞的數(shù)量明顯下降，并且Th2細胞分泌IL-4、IL-5的水平也明顯降低。不僅如此，全身性的過敏反應在OVA-SPs處理小鼠中也得到了有效抑制，血液中的嗜酸性粒細胞的數(shù)量以及血清OVA特異性抗體IgE的水平均明顯降低。同樣，在食物過敏模型中，預先給予WPE-SPs處理的小鼠，即使口服WPE后，仍能有效控制過敏癥狀，防止體溫的驟降以及減少小鼠肥大細胞蛋白酶-1(mMCP-1)的釋放，從而預防了全身性過敏反應的發(fā)生[19]。

綜上所述，Ag-SPs誘導的特異性的自身免疫耐受不僅能有效預防、治療由Th1/17介導的自身免疫病(如EAE、T1D)，對由Th2型細胞介導的過敏性疾病同樣有效。

3 ECDI作用機制研究

ECDI作為一種傳統(tǒng)的化學偶聯(lián)劑，好像一架橋梁將抗原肽或蛋白偶聯(lián)到細胞上，或者直接與細胞偶聯(lián)，在多種自身免疫病以及器官移植模型中都成功地誘導出了針對抗原的特異性的免疫耐受。然而，在此種方法的基礎上，Ag-SPs誘導免疫耐受的機制尚不完全明確，其可能的機制包括：

3.1誘導凋亡機制 近年來，有較多研究者在實驗中發(fā)現(xiàn)，ECDI可快速誘導偶聯(lián)的細胞發(fā)生凋亡[29,34]。凋亡的Ag-SPs通過靜脈注射的方式進入到宿主體內(nèi)后，迅速被脾臟邊緣區(qū)的巨噬細胞吞噬、加工，經(jīng)處理后的凋亡細胞免疫原性減弱，致耐受性增強，最后經(jīng)宿主的抗原提呈細胞(APCs)以非炎性的方式重新遞呈給自身抗原特異性CD4+T細胞，從而導致其克隆無能，失去或減弱對自身抗原的應答能力[29]。另一方面，在有抗原存在的情況下，ECDI首先與同基因型供體的脾細胞偶聯(lián)，再與抗原游離的氨基與羧基交聯(lián)，從而使抗原肽固定到供體細胞表面上，形成一個個“肽包裹著的細胞”，而這些細胞作為抗原的“載體”，經(jīng)ECDI誘導發(fā)生凋亡后同樣具有強大的致耐受性功能[25,35]。此外，Getts等[8]還發(fā)現(xiàn)，在ECDI處理3 h內(nèi)幾乎所有細胞失去其胞膜的完整性，并且Ag-SPs在進入宿主18 h內(nèi)能被脾臟邊緣區(qū)吞噬細胞完全吞噬清除，因此脾臟在Ag-SPs成功誘導耐受等方面也具有重要的作用。

3.2Treg的誘導調(diào)節(jié)機制 凋亡的Ag-SPs被宿主脾臟邊緣區(qū)吞噬細胞吞噬的同時，也能誘導巨噬細胞分泌IL-10，IL-10可能通過自分泌的方式進一步上調(diào)PD-L1的表達。不僅如此，Ag-SPs還能明顯誘導CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)的產(chǎn)生，Treg通過大量分泌IL-10和TGF-β等細胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。多個自身免疫病和器官移植模型的研究均表明，PD-1/PD-L1信號[36]和Treg[8,22]是維持其長期耐受的關鍵機制。Prasad等[13]在其研究中還發(fā)現(xiàn)，在Ag-SPs耐受誘導的起始階段，Treg同樣具有重要的調(diào)節(jié)作用，如果一旦缺乏Treg的表達，則會打破Ag-SPs的免疫耐受效應。

3.3共刺激信號分子通路機制 自身反應性CD4+T細胞逃避胸腺的陰性選擇，在外周活化的APCs的遞呈作用下，仍維持其對自身抗原的應答能力，而這也依賴于APCs表面共刺激信號分子的表達，即一旦缺乏共刺激信號分子，自身免疫性CD4+T細胞則活化無能。Podojil等[37]發(fā)現(xiàn)，Ag-SPs能明顯降低偶聯(lián)的APCs表面共刺激信號分子CD80/CD86的表達，從而在EAE等多個自身免疫病模型中安全、有效地誘導出了自身抗原特異性的免疫耐受。

當然，除了上述機制外，Ag-SPs還可能通過其他機制誘導抗原特異性的免疫耐受。比如，Ag-SPs可以直接調(diào)節(jié)TCR(宿主CD4+T細胞)與抗原肽MHC-Ⅱ類分子復合體的相互作用，從而阻斷自身反應性T細胞的活化[38]；Eagar等[39]還報道，CTLA-4對于誘導和維持Ag-SPs介導的免疫耐受具有重要的調(diào)節(jié)作用?？傊珹g-SPs誘導耐受的機制并不是單一的，而是多種機制協(xié)同作用的最終結果。

4 小結與展望

相比傳統(tǒng)的自身免疫病的治療方案，ECDI修飾的同基因型脾細胞偶聯(lián)抗原(Ag-SPs)誘導的免疫耐受主要具有以下優(yōu)勢：①較少的毒性作用和嚴重過敏反應；②能誘導抗原特異性的免疫耐受，個體化、特異性的治療方案減少了傳統(tǒng)免疫抑制劑廣泛的藥理作用所帶來的副作用；③能夠維持長期的免疫耐受，大量的動物實驗以及臨床試驗已證明，這種誘導耐受的方法對絕大多數(shù)自身免疫病均有明顯療效[37]。綜上所述，關于Ag-SPs用于自身免疫病的治療和機制的研究意義重大，是極具前景的研究方向。

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